转录因子Ets-1在2型糖尿病肾病中的表达及其意义

沈京群，刘殿阁，陈涵枝，丁弘，汪湜，周建东

(1．哈尔滨医科大学附属第一医院肾内科，黑龙江哈尔滨 150001;2．东南大学附属中大医院肾内科，江苏 南京 210009)

糖尿病肾病(DN)是糖尿病(DM)慢性微血管病重要并发症，是导致终末期肾衰的主要原因，病理特征为细胞外基质(ECM)在肾小球内过度积聚，这主要是由于ECM自身代谢紊乱所致［1］。Ets-1作为原癌基因，具有多种生物学功能，与编码蛋白酶的启动基因相互作用，增加基质金属蛋白酶-1(MMP-1)、MMP-2及尿纤溶酶原激活物(u-PA)基因启动活性，在诸多纤维化事件基质重塑中起重要作用［2-4］。本研究通过免疫组化，观察2型 DN肾组织内Ets-1、MMP-2、TIMP-2、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、波形蛋白(vimentin)及IV型胶原(ColⅣ)的表达，并探讨在2型DN基质重塑中的作用。

1 资料与方法

1． 1 一般资料

研究对象来自东南大学附属中大医院2004年1月至2009年12月成人病例45例，均经肾穿刺活检组织病理及免疫荧光证实，大部分病例行电镜检查。DN组按美国糖尿病学会2007年版的糖尿病诊疗标准选自同期肾穿刺活检证实DN 25例，其中男15例，女10例;年龄35～67岁，平均(41.72±7.02)岁。轻微病变性肾病(MCD)组按WHO(1982年及改良的1995年)肾小球疾病组织学分型方案选自同期肾穿刺活检证实MCD 20例，其中男12例，女8例;年龄18～46岁，平均(38.65±7.78)岁。两组在性别和年龄上无显著差异。排除标准:(1)1型DM、心力衰竭、发热、肿瘤、近期使用过影响肾功能的药物及免疫抑制剂者;(2)近期有手术和创伤史以及自身免疫性疾病;(3)3个月内患有心肌梗死、脑卒中、不稳定心绞痛等严重心脑血管疾病;(4)怀孕或哺乳期妇女。

1． 2 方法

1．2.1 肾脏病理组织学检查 肾组织石蜡切片(4 μm)，进行 HE、PAS、PAM 和 Masson 染色，光镜下观察组织病理学变化。

1．2.2 免疫组化 采用SP法［5-6］。石蜡切片常规脱蜡水化后，用10%山羊血清或10%兔血清封闭，分别滴加适当稀释的第一抗体，4℃过夜。滴加生物素标记的第二抗体，再加辣根过氧化物酶(HRP)标记链霉素亲合素，联苯胺(DAB)显色。第一抗体如下:Ets-1(美国Santa Cruz公司)，MMP-2和 TIMP-2(Chemicon公司)，α-SMA(Dako公司)，Vimentin抗体(Dako公司)，ColⅣ(Chemicon公司)。应用Image Pro Plus 6.0图像分析软件半定量分析，分别对肾小球及肾小管间质各种抗原蛋白的表达量进行统计分析，计算染色阳性部位(棕色染色区域)相对IOD(累积光密度)。

1．2.3 免疫组化双重染色 碱性磷酸酶(AP)、辣根过氧化物酶(HRP)不同显色完成［5-6］。切片用抗Ets-1或α-SMA单克隆抗体孵化，然后用生物素标识的第二抗体和AP标记的抗生物素卵白素分别孵化，用BCIP/NBT显色，呈紫黑色。染有Ets-1或α-SMA的切片用HRP标记的抗生物素卵白素进行复染MMP-2或ColⅣ，用AEC/H2O2显色，呈深红色。

1． 3 统计学处理

数据均以¯x±s表示，用SPSS 13.0软件处理，方差齐时采用t检验，方差不齐时采用t'检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2． 1 肾脏组织病理改变

MCD组仅见肾小球系膜区扩展，未见基底膜增厚，肾小管及肾间质大致正常。DN组可见肾小球内渗出性病变、肾小球基底膜弥漫增厚及系膜细胞及系膜基质弥漫性增生，可见肾小管上皮细胞肿胀、间质内炎症细胞浸润及纤维化形成。

2． 2 免疫组化表达

两组肾内 Ets-1、MMP-2、TIMP-2、α-SMA、Vimentin及ColⅣ免疫组化半定量分析结果见表1。

表1 Ets-1、MMP-2、TIMP-2、α-SM、vimentin及ColⅣ免疫组化半定量分析(x¯±s)

MCD组肾内Ets-1微量表达(图1A)。与MCD组比较，DN组肾小球及肾小管间质细胞核内Ets-1表达明显增加(图1B)，差异有统计学意义(P＜0.05)。MCD组肾内MMP-2弱阳性表达(图2A)。同MCD组比较，DN组肾内可见MMP-2增加性表达(图2B，P＜0.05)。与MCD组(图3A)相比，DN组肾内TIMP-2表达显著性增加(图3B，P＜0.05)。DN组肾小球及肾小管间质内MMP-2/TIMP-2比值显著性降低，差异具有统计学意义(0.57±0.31 vs 1.43±1.20，0.82±0.40 vs 1.64±1.55，均P＜0.05)。MCD组肾内血管壁强阳性表达外，肾小球及肾小管间质轻微表达(图4A)。与MCD组比较，DN组肾内α-SMA表达显著性增加(图4B，P＜0.05)。MCD组Vimentin主要在肾小球内阳性表达(图5A)。同 MCD组相比，DN组Vimentin在肾小球表达明显增加(图5A，P＜0.05)，而Vimentin在肾小管间质内的表达显著性增加(图5A，P＜0.01)。MCD组ColⅣ在肾小球基底膜及肾小管基底膜均有明确表达(图6A)。与MCD组比较，DN组ColⅣ在肾小球及肾小管间质内表达显著性增加(图6B，P ＜0.01)。

2． 3 免疫组化双重染色

免疫双染显示，DN组大多数表型发生变化的α-SMA阳性(黑色)肾小球系膜细胞、肾小管间质细胞同时具有ColⅣ的阳性表达(红色)(图7A)，在增生硬化的肾小球系膜细胞及病变的肾小管间质处ColⅣ表达阳性细胞(红色)内亦有α-SMA阳性表达(黑色)(图7A)。增生硬化的肾小球及病变的肾小管间质内Ets-1表达阳性细胞(黑色)亦可见MMP-2阳性表达(红色)(图7B)，在增生硬化的肾小球及病变的肾小管间质区Ets-1细胞(黑色)具有MMP-2阳性表达(红色)(图7B)。

图1 Ets-1免疫组化表达(SP×200)

图2 MMP-2免疫组化表达(SP×200)

图3 TIMP-2免疫组化表达(SP×200)

图4 α-SMA免疫组化表达(SP×200)

图5 vimentin免疫组化表达(SP×200)

图7 免疫组化双重染色(×200)

3 讨 论

DN是DM微血管病变的常见并发症之一，也是2型DM患者的首位死因。DN肾组织早期病理改变为肾小球肥大、ECM聚集、基底膜增厚，晚期出现弥漫性肾小球硬化及肾小管间质纤维化，导致肾功能衰竭［7］。因此探讨DN的发病机制及寻找防治DN的有效方法，已成为当前临床医学研究的重要课题。

Ets-1是转录因子ets家族成员之一，与v-est原癌基因高度同源性。Ets-1蛋白通过DNA连接区域结合中央GGA的核心序列 (PEA3)，在AP-1位点与CFos/c-Jun复合物相互作用，从而激活特定的启动因子表达［8］，包括 MMP-1、2、3、9，u-PA，TIMP-1 及 TIMP-2，表明Ets-1原癌基因在MMPs调控中起关键性作用。

MMPs是一组能特异地降解ECM成分的锌(Zn2+)依赖的酶家族，由结缔组织细胞、内皮细胞、单核巨噬细胞、中性粒细胞、肾小球固有细胞、肾小管上皮细胞、肿瘤细胞等合成与分泌，并有特异性的天然抑制剂TIMPs抑制其活性［9］。MMPs能降解几乎所有的ECM成分。MMP-2为明胶酶的一种，它主要定位于肾小球，是ColⅣ的主要降解酶。TIMPs是MMPs的特异性组织抑制物，与活化型MMPs高亲和，以1∶1比例非共价键结合形成 MMP-TIMP复合体，从而阻断MMPs与底物的结合和活化，对MMPs有不同程度的抑制作用，作为肾内调节MMPs活性的主要物质而参与ECM代谢的调节过程［10］。生理状态下，MMPs/TIMPs处于一种动态平衡中，维持ECM正常代谢;在病理状态时该平衡状态被打破，造成ECM的代谢紊乱。TIMP-2是一种非糖化的由194个氨基酸组成的蛋白质，其分子量为21 kD，可特异性抑制MMP-2的活性而导致ECM积聚［11］。

本研究表明，2型DN肾内Ets-1原癌基因明显增高，同时，MMP-2的表达亦增加。但是，TIMP-2表达增加更为明显，引起MMP-2/TIMP-2比值显著性下降，ECM降解少于合成，最终导致胶原过度沉积。因此，有理由推测:Ets-1表达增高可能通过上调MMP-2的表达，进而使ECM降解增加。但是，尚不足以克服因TIMP-2表达显著上调而导致ECM合成大于降解，引起2型DN肾小球硬化及肾小管间质纤维化发生。免疫双染显示，DN组肾小球固有细胞及肾小管间质细胞内Ets-1增加性表达，往往同时伴有MMP-2阳性表达，表明Ets-1可能是上调MMP-2表达的客观形态学依据，进一步证实了Ets-1与MMP-2/TIMP-2系统平衡的密切关系。免疫双染表明多数α-SMA阳性的肾小球固有细胞及肾小管间质细胞同时具有ColⅣ阳性表达，提示α-SMA阳性的肌成纤维细胞分泌胶原成分，导致ECM过度沉积。

本研究首次探讨了Ets-1在2型DN中的表达及基质重塑过程的重要影响，但是有关Ets-1的调节机制尚不明确。研究已表明，DM发生进展过程中高血糖状态往往伴随复杂性炎症反应，同时DN时存在肾组织缺血、缺氧，后者又加重炎症反应，诸多炎症介质与Ets-1的表达有关。例如，AngⅡ参与的MAPK信号通路的ERK1/2、p38和JNK能将外部刺激传到核内，激活转录调节因子包括Ets家族，引起下游基因表达的时空变化［12］，Ets-1在肾小球系膜细胞培养中的表达上调可以有效阻止TGF-β诱导的Ⅰ型胶原产生，并能拮抗TGF-β的表达，也提示Ets-1可能通过作用TGF-β受体在 TGF-β参与的 Smad及 RhoA Rhokinase、MAPK信号转导通路中起重要作用［13］。此外，低氧血症、酸中毒及微环境营养不良等诱导多种细胞因子和生长因子的分泌，均能上调Ets-1的活性。因此，有理由推测本研究中Ets-1表达上调可能与以上因素有一定关系。总之，Ets-1转录因子可能通过调节MMP-2/TIMP-2系统平衡而影响ECM代谢，在2型DN基质重塑过程中起重要作用。

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