川芎嗪对大鼠心肌再灌注损伤保护机制的实验研究

吕磊，孟庆欣，徐军，宫剑滨，承燕，江时森

(1．南京大学医学院 临床学院，江苏南京 210002;2．南京军区南京总医院心血管内科，江苏 南京 210002;3．南京军区南京总医院超声诊断科，江苏南京 210002)

血运重建术已经成为缩小急性心肌梗死后最终梗塞面积，保存左室功能，改善临床预后的最有效的方法，但同时也能导致严重的缺血再灌注(ischemia reperfusion，IR)损伤。如何减轻心肌IR损伤一直是冠心病防治中亟待解决的重要问题［1］。近年研究发现，再灌注时磷脂酰肌醇-3激酶 (phosphatidylinositol-3-OH kinase，PI3K)/蛋白激酶B(Akt)的激活是心肌保护的重要机制之一，能通过激活下游靶目标，促进心肌细 胞 存 活 和 缩 小 梗 死 面 积［2］。川 芎 嗪(tetramethylpyrazine，TMP)是中药川芎的有效单体成分，具有抗血小板聚集、扩张小动脉、改善微循环及活血化淤等作用，在心血管疾病中有重要的应用前景。本研究拟探讨川芎嗪对在体大鼠心肌IR的保护作用和量效关系及其可能作用机制，为临床防治心肌IR损伤提供理论基础。

1 材料与方法

1． 1 实验动物

健康雄性SD大鼠56只，体质量250～280 g，由南京军区南京总医院实验动物中心提供。

1． 2 药物和试剂

川芎嗪(中国药品生物制品检定所)，渥曼青霉素、三苯基氯化四氮唑(TTC)(Sigma-Aldrich公司)，抗Akt、抗磷酸化Akt(serine 473)、抗内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、抗磷酸化eNOS(serine 1177)多克隆抗体(CST公司)，辣根过氧化酶羊抗兔IgG抗体(Sigma公司)，蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(Thermo Scientific公司)，超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)试剂盒(南京建成生物工程公司)。

1． 3 实验仪器

小动物呼吸机TKR200C型(江西省特立麻醉呼吸设备公司)，美国 Polytron MR2100匀浆器，美国 BIORAD电泳仪，日立7600型全自动生化分析仪。

1． 4 实验方法

1．4．1实验分组 大鼠随机分成6组。(1)假手术组(n=6):开胸，只穿线不结扎冠状动脉;(2)IR组(n=10):开胸结扎冠状动脉前降支35 min，再灌注120 min，建立IR损伤模型;(3)川芎嗪低剂量组(TMP-L组，n=10):结扎前降支前5 min静脉给予川芎嗪5 mg·kg－1，余同IR组;(4)川芎嗪中剂量组(TMP-M组，n=10):川芎嗪10 mg·kg－1，余同TMP-L组;(5)川芎嗪高剂量组(TMP-H 组，n=10):川芎嗪30 mg·kg－1，余同 TMP-L组。(6)川芎嗪+渥曼青霉素组(TMP+Wort组，n=10):缺血前5 min静脉给予川芎嗪10 mg·kg－1，再灌前15 min 给予 PI3K 抑制剂渥曼青霉素15 μg·kg－1，余同IR组。

1．4．2 在体大鼠IR模型的建立和标本采集 氯胺酮(150 mg·kg－1)腹腔注射麻醉，同时给予肝素(500 IU·kg－1)，仰卧位固定，记录Ⅱ导联心电图。颈部正中切口气管切开接小动物呼吸机机械通气(潮气量8 ml·kg－1，频率60 次·min－1)。胸骨左缘3-4 肋间开胸，暴露心脏，打开心包，于左心耳与肺动脉圆锥之间左心耳下方3 mm处前降支贯穿6-0无损伤缝线，结扎前降支。结扎后心电图Ⅱ导联提示J点明显抬高，QRS波增宽以及结扎线以下左室前壁出现紫绀为结扎成功。持续缺血35 min后剪断结扎线再灌注120 min。抽取大鼠右房血，3 000 r·min－1离心 5 min，留取上清检测心肌酶。每组4只行左室心肌梗死面积测定，余留取左室缺血区心肌约150 mg，快速液氮冷冻，随后移入－80℃冰箱冻存待检。

1．4．3 心肌梗死面积的测定(伊文蓝/TTC双染色法) 在120 min再灌注结束时于原结扎点重新结扎前降支，尾静脉注入2%伊文蓝2 ml，心外膜蓝染后获取心脏，－20℃冰冻30 min，将心脏从心尖至心底横向均匀切片，生理盐水冲洗干净，将心肌片放在1%TTC磷酸盐缓冲液中，37℃孵化20 min染色，此时蓝色为非缺血区心肌，灰白色为梗死心肌，砖红色和灰白色为缺血区心肌。10%甲醛中固定过夜，数码相机拍照，Image J绘图软件(美国NIH)测定左室梗死面积，梗死心肌范围用梗死面积/缺血面积百分比表示。

1．4．4 SOD活性和MDA含量的测定 再灌注结束后，将心脏组织制备心肌匀浆上清液。按试剂盒要求，黄嘌呤氧化酶法检测SOD活性，硫代巴比妥酸(TBA)显色法测定MDA含量。

1．4．5 Western blotting 测定心肌组织中磷酸化 Akt、Akt、磷酸化eNOS和eNOS含量 应用裂解液(含蛋白酶和磷酸酶抑制剂)提取心肌标本总蛋白，考马斯亮蓝测定蛋白浓度。加样总蛋白40 μg，以上样缓冲液等体积稀释，室温下聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白质电转至聚偏二氟乙烯膜，室温下脱脂奶粉缓冲液封闭，将PVDF膜用相应一抗(磷酸化 Akt、Akt、磷酸化 eNOS、eNOS，1∶1 000稀释)封闭，4℃过夜。加入辣根过氧化酶标记的二抗(1∶5 000稀释)封闭液中，室温孵育2 h，行发光检查并曝光分析，采用Bio-Rad公司的Gel Doc2000凝胶图像专用软件分析目标条带的积分吸光度值(IA=平均吸光度×面积)，分别以磷酸化Akt/Akt、磷酸化 eNOS/eNOS值反映 Akt、eNOS的相对活化水平。

1． 5 统计学处理

数据以¯x±s表示，应用SPSS 13．0软件进行分析。各组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK检验，P＜0．05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2． 1 心肌酶结果

再灌注结束时，IR组血清CK-MB、LDH含量分别为(7 355．8 ±870．5)U·L－1和(1 667．4 ±147．8)U·L－1。川芎嗪各组CK-MB及LDH均低于IR组(均P＜0．05)，加用渥曼青霉素后，大鼠血清 CK-MB及LDH水平明显增高(TMP+Wort组与TMP-M组相比较，P ＜0．05)，见表1。

表1 各组大鼠心肌损伤标志物及氧化应激水平(n=6，¯x±s)Tab 1 The levels of enzymatic dynamics and oxidative stress of myocardium(n=6，)

表1 各组大鼠心肌损伤标志物及氧化应激水平(n=6，¯x±s)Tab 1 The levels of enzymatic dynamics and oxidative stress of myocardium(n=6，)

与 IR 组比较，a P ＜0．05;与 TMP-M 组比较，b P ＜0．05

(U·mg－1)5．9a 4．3b 4．8 3．2a TMP-H 组 832．6 ±158．2a 4 702．0 ±796．3ab 0．331 ±0．023a 51．2 ±6．4a TMP+Wort组 1 289．2 ±103．9ab 7 215．6 ±530．0b 0．458 ±0．061a 48．4 ±3．5a

2． 2 心肌梗死面积测定结果

假手术组未见明显缺血及梗死区，IR组大鼠心肌梗死面积为(50．4±4．6)%;中、高剂量川芎嗪预处理能减少心肌梗死面积［分别为(38．7±4．5)%和(36．3±4．3)%，与(50．4 ±4．6)% 相比较，均 P ＜ 0．05］;TMP-L组和TMP+Wort组大鼠心肌梗死面积分别为(46．9 ±3．1)%和(49．8 ±4．7)% ，与 IR 组相比，差异均无统计学意义(P＞0．05)。

2． 3 各组心肌SOD活性、MDA含量

川芎嗪中、高剂量组与IR组相比，心肌SOD活性增加，MDA含量降低(P＜0．05)，川芎嗪低剂量组与IR组的SOD活性无明显差异(P＞0．05)，见表1。

2． 4 各组大鼠心肌组织中磷酸化 Akt和磷酸化eNOS的蛋白表达结果

与IR组相比，川芎嗪中、高剂量组磷酸化Akt蛋白表达明显增高［分别为1．61 ±0．18、1．65 ±0．18，与0．79±0．10(IR 组)相比较，均 P ＜0．05］，川芎嗪各组的磷酸化eNOS蛋白表达亦明显增高［低、中、高组分别为 1．69 ±0．41、1．87 ±0．33、3．21 ±0．62，与0．94±0．22(IR 组)相比较，均 P ＜0．05］。渥曼青霉素能显著抑制TMP所致的Akt和eNOS磷酸化(TMP+Wort组的磷酸化 Akt为 0．54 ±0．15，磷酸化eNOS为0．53±0．14，与 IR 组相比较，均 P ＞0．05)。见图1。

图1 心肌组织中磷酸化Akt(p-Akt)和磷酸化eNOS(p-eNOS)的蛋白表达结果Fig 1 Western blotting analysis of Akt and eNOS phosphorylation in rat cardiac tissue

3 讨 论

心肌缺血再灌注损伤仍是目前亟待解决的问题［1］。缺血再灌注时心肌缺血首先可导致心肌酶漏出、收缩偶联障碍，进一步则可导致不可逆的细胞损伤和死亡。CK-MB是临床诊断急性心肌梗死应用最广泛的酶，由于CK-MB主要存在于心肌内，对心肌坏死的检出较为特异，是心肌损伤的特异和敏感指标，对判断心肌梗死的扩展、早期心肌梗死、估计心肌梗死的范围等有重要意义。本研究结果表明，在体大鼠缺血再灌注损伤模型中，川芎嗪组大鼠心肌梗死面积、心肌CK-MB和LDH水平低于IR组，中剂量及高剂量组尤为明显，说明川芎嗪可以减轻心肌细胞膜的损伤，降低心肌酶的释放，减少心肌梗死面积。

氧自由基生成是心肌再灌注损伤的主要病理机制之一，再灌注过程中大量氧自由基和活性氧的产生可以直接损伤心肌细胞，导致细胞结构、功能改变，引起细胞损伤与死亡［3］。SOD是一类广泛存在于生物体内的金属酶，是内源性氧自由基清除剂，可清除生物体内在利用氧过程中产生的超氧离子，其值间接反映机体清除氧自由基的能力。MDA是生物膜发生脂质过氧化反应的重要产物，能较好反映组织脂质过氧化程度，是衡量氧自由基对细胞损害的标志之一［4］。既往研究表明，在脑缺血再灌注损伤［5-6］及肾小管［7］缺血再灌注损伤模型中，川芎嗪均有抗氧化作用。在本实验中，与IR组相比，川芎嗪中、高剂量组SOD活性增加而MDA含量降低，表明川芎嗪能有效减轻氧化应激水平，清除氧自由基，减轻脂质过氧化，保护线粒体结构和功能。这与文献报道［8-10］一致。上述结果分别从酶学、宏观病理、氧化应激指标等方面说明川芎嗪对IR损伤心肌有保护作用。本研究还发现，低剂量川芎嗪(5 mg·kg－1)大鼠心肌梗死面积较IR组差异无统计学意义，而中、高剂量川芎嗪(分别为10 mg·kg－1和30 mg·kg－1)预处理能显著减少心肌梗死面积，中、高剂量川芎嗪组氧化指标较低剂量组也有改善，提示川芎嗪对心肌IR损伤的保护作用与剂量相关。

PI3K是生长因子超家族信号传导过程中的重要分子，可被多种细胞因子和理化因素激活。PI3K下游有多种效应分子，Akt处于这一通路的中心环节，是PI3K下游直接和最主要的靶酶。Akt通路主要负责由PI3K始动的生物信息的传导，在细胞代谢、细胞周期调控和细胞生长凋亡等多种生物学过程中发挥着重要作用，降低缺血再灌注损伤的发病率及死亡率［11-12］。PI3K/Akt是近年来研究较多的信号通路，是再灌注挽救激酶信号通路的重要组成部分［3］。在再灌注初期，各种心肌保护手段能主动募集PI3K/Akt信号转导通路。多项研究表明，缺血预适应和缺血后处理等机械干预和药物干预(如他汀、腺苷、心房钠尿肽等)均能在再灌时激活PI3K/Akt信号通路，促进心肌细胞存活和缩小梗死面积［13］。本研究表明，川芎嗪中、高剂量组上调了磷酸化Akt的表达，但PI3K抑制剂渥曼青霉素能消除TMP所致的Akt的磷酸化，提示TMP激活了PI3K/Akt信号通路。

PI3K/Akt信号通路涉及多种细胞内信号转导介质和效应蛋白。其中，eNOS是PI3K/Akt信号通路的下游靶点之一［14］。Akt的活化使eNOS的表达上调，eNOS丝氨酸1177位点的磷酸化导致其活性增加，最终通过减少线粒体通透性转换孔的开放，改善线粒体能量的生成，保持线粒体外膜的稳定性，从而减少凋亡和保存心肌［15］。近年研究发现，川芎嗪能逆转高葡萄糖所致内皮细胞磷酸化eNOS的下调，增加一氧化氮含量，保护内皮细胞［8］。本研究中，川芎嗪各组均上调了磷酸化eNOS的表达，PI3K抑制剂渥曼青霉素能消除TMP所致的eNOS的磷酸化，表明TMP所致的eNOS的激活是通过PI3K/Akt信号通路产生的。而TMP+Wort组心梗面积较IR组无明显差异，提示渥曼青霉素能减弱TMP的心肌保护作用。因此，本实验证实，川芎嗪对心肌缺血再灌注损伤的保护作用可能与PI3K/Akt-eNOS信号通路的激活有关，并通过依次激活下游靶目标，从而发挥心肌保护作用。

PI3K/Akt的下游靶点还包括B细胞淋巴瘤/白细胞2(Bcl-2)家族、糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)、天冬氨酸蛋白酶9(caspase-9)、70 kD核糖体蛋白s6激酶(p70S6K)等［16］，这些靶酶是否参与川芎嗪对在体大鼠心肌再灌注损伤的保护作用，尚待进一步研究。

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