Wnt 通路对胰岛素样生长因子-1抑制小鼠毛细胞凋亡的作用
2012-01-06宫亮,李里,陈冬
宫 亮,李 里,陈 冬
(辽宁医学院 附属第一医院 1.耳鼻咽喉科,2.儿科,辽宁 锦州 121000)
Wnt 通路对胰岛素样生长因子-1抑制小鼠毛细胞凋亡的作用
宫 亮1,李 里2,陈 冬1
(辽宁医学院 附属第一医院 1.耳鼻咽喉科,2.儿科,辽宁 锦州 121000)
目的 探讨胰岛素样生长因子-1(IGF-1)抑制小鼠毛细胞凋亡作用的调控机制。方法 体外培养新生小鼠耳蜗基底膜。在分别含有正常对照培养液(A组)、0.5 mmol/L庆大霉素(GM)(B组)、0.5 mmol/L GM+1 ng/mL IGF(C 组)、0.5 mmol/L GM+1 ng/mL IGF+5 μg/mL wif(D 组)、0.5 mmol/L GM+1 ng/mL IGF+10 μg/mL wif(E组)、0.5 mmol/L GM+1 ng/mL IGF+15 μg/mL wif(F组)的成分中培养24 h后收集细胞及固定。应用TUNEL法观察各组耳蜗毛细胞的凋亡情况。应用Western blot及Real-time PCR法观察Caspase-3的表达情况。结果 B组耳蜗毛细胞经刺激后,细胞凋亡数量及Caspase-3 mRNA和蛋白表达较A组明显上升(P<0.01),C组耳蜗毛细胞经IGF刺激后,细胞凋亡数量及Caspase-3mRNA和蛋白表达较B组明显下降(P<0.01),应用Wnt阻断剂(wif)后D、E及F组细胞凋亡数量及Caspase-3 mRNA和蛋白表达较C组升高,其中F组升高显著(P<0.01)。结论 IGF可能通过激活Wnt通路抑制毛细胞凋亡。
胰岛素样生长因子-1;Caspase-3;毛细胞;凋亡
胰岛素样生长因子-1(IGF-1)是在动物体内存在的一种生长因子,调控耳蜗生长发育及细胞间协调稳定。近些年对神经细胞的保护治疗研究中各种神经营养因子都进行了广泛研究[1-2],虽然IGF-1在神经细胞损伤防护中已得到广泛应用,但在耳蜗发育中的变化以及对耳蜗毛细胞和螺旋神经节细胞的保护作用及作用机制尚不完全明确。本研究应用庆大霉素(GM)建立药物性耳聋损伤模型,研究IGF-1抑制耳蜗细胞凋亡的可能机制,探讨IGF-1在药物性耳聋防治中的作用。
1 材料
胎牛血清及DMEM培养基购自美国标准生物品收藏中心(American Type Culture Collect ion,ATCC);IGF-1由美国Genentech公司惠赠;wif(Wnt抑制因子)购自美国Santa Cruz公司;Real-time PCR试剂盒购自美国Qiagen公司;抗Caspase-3抗体及二抗购自美国Santa Cruz公司;TUNEL检测试剂盒购自美国Clontech公司。
MRC-1024激光共聚焦显微镜(BioRad,Watford,UK)。
2 方法
2.1 细胞培养及分组
取新生小鼠(4 d)耳蜗基底膜进行离体培养24 h后更换培养液[3]。共分为6组:正常对照培养液[3]组(A 组)、0.5 mmol/L GM(B 组)、0.5 mmol/L GM+1 ng/mL IGF(C 组)、0.5 mmol/L GM+1 ng/mL IGF+5 μg/mL wif(D 组)、0.5 mmol/L GM+1 ng/mL IGF+10 μg/mL wif(E 组)以及 0.5 mmol/L GM+1 ng/mL IGF+15 μg/mL wif(F 组),每组8 个样本。加药处理48 h后收集细胞。
2.2 观察指标及方法
2.2.1 TUNEL染色检测耳蜗毛细胞凋亡 制作各组耳蜗组织铺片;加用荧光素(FITC)标记的核苷酸和脱氧核苷酸末端转移酶混合液;阴性对照为省去TUNEL的反应液。对耳蜗基底膜细胞系进行TUNEL染色,经4%多聚甲醛固定后,置穿透液中,4℃,2 min,以核阳性作为结果判定标准。激光共聚焦显微镜下观察。
2.2.2 激光共聚焦显微镜观察 用相应波长激光激发后(FITC为514 nm,Cy3为554 nm,Cy5为610 nm)在激光共聚焦显微镜下观察。
2.2.3 Caspase-3蛋白和基因表达检测 采用Western blot技术检测脑白质Caspase-3蛋白的表达:将总蛋白经聚丙烯酰胺凝胶电泳后(每一样本均含总蛋白60 μg),转印至硝酸纤维素膜上,采用增强化学发光法检测Caspase-3的表达。所用抗体为羊抗Caspase-3及辣根过氧化物酶标记的马抗羊抗体。采用HPlsA 1000图文分析系统分析胶片,用Caspase-3的灰度值表示Caspase-3的相对表达水平。
采用Real-time PCR技术检测Caspase-3 mRNA的表达。参照Trizol说明书操作。采用Access RT PCR系统(Promega公司)将由脑白质提取的总RNA 1 μg一步法扩增成DNA目的片段。反应循环参数为:48℃ 45 min;94℃ 2 min;94℃ 30 s,58℃ 30 s,72℃ 60 s,共35个循环;72℃ 10 min;4℃保存。Caspase-3引物序列:上游序列为 5'GAATCCACGAGCAGAGTCAA 3',下游序列为 5'AAGCCAACCAAGTTCAAGTTCACACA 3',目的片段为205 bp;内参照 β-actin上游序列为5'ACGTTGACATCCGTAAAGAC 3',下游序列为 5'GAAGGTGGACAGTGAGGC 3',目的片段为200 bp。用Caspase-3与β-actin的灰度比值表示Caspase-3的相对表达水平。
2.3 统计学处理
3 结果
3.1 激光共聚焦显微镜观察凋亡细胞
观察结果见图1。激光共聚焦显微镜观察凋亡细胞为红色。A组未检测到凋亡细胞;B组加入GM后,凋亡细胞明显增多;C组将GM及IGF1共同加入后细胞凋亡明显减少;应用Wnt阻断剂wif后,凋亡细胞较未加入wif明显增加,其中F组凋亡细胞增加明显。
3.2 耳蜗毛细胞Caspase-3蛋白及mRNA相对表达量
图1 各组凋亡细胞观察结果
加药处理48 h后,Caspase-3蛋白及mRNA表达,B组较A组明显增高(P<0.01);C组较B组明显减少(P<0.05);E和F组较C组明显增高(P<0.01 或0.05)。Western blot结果及 Real-time PCR结果分别见图2和表1。
图2 加药48 h后各组Caspase-3蛋白表达
表1 Caspase-3蛋白及mRNA相对表达量(n=8,x±s)
4 讨论
耳蜗毛细胞是重要的感音细胞,听发育期毛细胞数量减少或功能损伤可引起成年后机体听力损伤。耳蜗毛细胞凋亡是听力功能下降的主要原因[4]。IGF-1是一种含70个氨基酸的单链多肽是一种内源性神经营养因子,有研究表明,敲除IGF-1基因的鼠在内耳发育期出现内耳细胞凋亡,而且出现听力减退,提示IGF-1对内耳毛细胞凋亡调节有一定的影响[5-6]。Lakhani等[7]研究表明,IGF-1 可以保护耳蜗毛细胞免于凋亡。本课题组前期实验结果证实[3],IGF-1能够抑制GM诱导离体培养的小鼠耳蜗毛细胞凋亡的发生,对耳蜗毛细胞有保护作用,但这一保护作用的精确分子机制目前尚不清楚。
耳蜗毛细胞在耳蜗的形成、发育、修复过程中发挥重要作用。Wnt/β-catenin信号通路在耳蜗毛细胞的分化、增殖及凋亡过程中发挥着重要的作用。Wnt/β-catenin信号通路与其他途径及蛋白相互协调作用于耳蜗组织[8]。IGF-1是耳蜗形成的调节因子,具有促进有丝分裂等作用,在耳蜗形成过程中发挥了重要的生理作用。在IGF-1抑制耳蜗毛细胞凋亡的过程中,Wnt信号转导通路是否参与其作用尚不清楚。为进一步明确IGF-1对小鼠耳蜗毛细胞凋亡的影响及Wnt信号转导通路在该过程中的作用,实验以IGF-1及GM联合作用于小鼠耳蜗毛细胞,探讨IGF-1对耳蜗细胞凋亡的影响及在此过程中阻断Wnt/β-catenin信号通路对耳蜗毛细胞凋亡的影响。本文应用Wnt通路阻断剂wif阻断Wnt通路观察耳蜗毛细胞凋亡的情况。
本研究结果表明,与A组相比,B组凋亡细胞明显增加,表明GM诱导耳蜗毛细胞凋亡导致耳蜗毛细胞损伤。与B组相比,加入IGF-1后,凋亡毛细胞明显减少,说明IGF-1可以抑制毛细胞凋亡。本实验前期工作已经证实在不同时间点不同剂量的应用IGF-1可以抑制毛细胞凋亡。将Wnt通路阻断剂加入耳蜗毛细胞后与C组比较,E和F组毛细胞凋亡率明显增高,表明将Wnt通路阻断后抑制了IGF-1的抗凋亡作用,说明IGF-1的抗凋亡作用可能通过Wnt通路调节。
本研究应用Wnt通路阻断剂wif后耳蜗毛细胞中Caspase-3蛋白和基因表达较仅应用IGF-1组明显增加,表明阻断Wnt通路后,IGF-1的抗凋亡作用受到抑制,推测IGF-1的抗凋亡作用可能通过Wnt通路调节。其具体机制尚需进一步研究。
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The effect of Wnt pathway on antiapoptosis activity by Insulin-like Growth Factor-1 in cochlear hair cells in rat
GONG Liang1,LI Li2,CHEN Dong1
(1.ENT Department,2.Pediatric Department,the No.1 Affiliated Hospital of Liaoning Medical University,Jinzhou 121001,China)
Purpose To investigate the gene regulation mechanism of Insulin-like Growth Factor-1(IGF-1)antiapoptosis activity on rat hair cells.Methods Basilar membrane of cochlea of newly born mice were cultured in vitro in six group:control culture solution(group A),0.5 mmol/L GM(gentamicin)(group B),0.5 mmol/L GM+1 ng/mL IGF-1(group C),0.5 mmol/L GM+1 ng/mL IGF-1+5 μg/mL wif(group D),0.5 mmol/L GM+1 ng/mL IGF-1+10 μg/mL wif(group E),0.5 mmol/L GM+1 ng/mL IGF-1+15 μg/mL wif(group F).After cultured,cochlear preparation were made by used TUNEL method,the apoptosis of cochlear hair cells was observed with laser scanning confocal microscope.Caspase-3 protein and m RNA was examed by western blot and real-time PCR.Results There was no apoptosis cell labeled by TUNEL in basilar membrane in group A.Apoptosis cells labeled by TUNEL in basal,in group B,was higher than that in group A(P <0.05).Apoptosis cells in group C was lower than that in group B(P <0.05).Apoptosis cells in group D,E,F were higher than that in group C,especialy in group F.The expression of Caspase-3 showed the same result.Conclusion Wntpathway plays an important role in the process of apoptosis in cochlear hair cells by IGF-1.
Insulin-Like Growth Factor-1;Caspase-3;hair cells;apoptosis
R961
A
1005-1678(2012)06-0766-03
2012-08-22
辽宁省教育厅高等学校科研项目(2009A460)
宫 亮,男,硕士,主治医师,主要从事耳鼻咽喉科疾病的基础和临床,尤其是耳神经外科及相关基础研究;陈 冬,男,通信作者,副主任医师,副教授,E-mail:entdoctorchen@163.com。