W/O/W 复乳溶剂蒸发法制备水溶性药物微球研究进展

袁清霞，赵龙岩，程 杰，曾富华

(1．湛江师范学院 生命科学与技术学院，广东 湛江 524048;2．湖南农业大学 生物科学技术学院，湖南 长沙410128)

W/O/W 复乳溶剂蒸发法制备水溶性药物微球研究进展

袁清霞1，2，赵龙岩1，程 杰1，2，曾富华1

(1．湛江师范学院 生命科学与技术学院，广东 湛江 524048;2．湖南农业大学 生物科学技术学院，湖南 长沙410128)

介绍了W/O/W复乳溶剂蒸发法制备水溶性药物微球的基本步骤及存在问题，重点综述制备工艺的关键影响因素，并在此基础上阐述W/O/W复乳溶剂蒸发法技术的研究进展，提出该法在实际应用中存在的主要问题，并对其发展前景进行展望。

W/O/W复乳溶剂蒸发法;微球;综述

与传统剂型相比，药物微球有减少给药次数、改善患者顺从性、保持药物活性等优点。被包囊药物中，水溶性成分占很大一部分。因此，近年来制备水溶性药物微球得到越来越多的关注。W/O/W复乳溶剂蒸发法以其操作简单、控制工艺参数方便、无需调节pH和大幅变温，且相比单乳液体系大大提高了微球的载药量和包囊率，具有可控释等优势而常用于包囊水溶性芯材。

W/O/W复乳液又称乳液的乳液，分散相(水相)液滴本身包含更小的分散相液滴，也就是溶有芯材的内水相包囊在油滴中，油包水液滴再分散到外水相中，油相(连续相)将内外水相分开，可看作薄的半透性膜［1］。该技术由Vrancken和Claeys于1970年获得专利［2］，现已广泛应用于医药领域。

1 W/O/W复乳溶剂蒸发法制备水溶性药物微球的基本步骤及存在问题

W/O/W复乳溶剂蒸发法制备水溶性药物微球的过程可大致分为四个步骤:首先，溶有药物的水溶液(W1，内水相)分散在溶解囊壁材料的有机溶剂(O，油相)中，形成W1/O初乳液;随后，将W1/O初乳液分散在水溶液(W2，外水相)中获得W1/O/W2复乳液;第三步，去除有机溶剂，固化微球;最后，离心收集微球，洗涤、干燥［3-4］。

复合乳液系统制备简单，但同样存在自身缺点。相对单乳液，W/O和O/W界面过多的自由能导致复合乳液热力学不稳定;复合乳液系统自身组成和微结构也会引起一系列不稳定的破坏途径，不稳定的主要机制可概括为:①外部液滴聚集;②内部液滴聚集，但外液滴界面不改变;③内部液滴聚集，外部液滴界面也发生变化，内部水相分散到外水相;④内部液滴收缩或膨胀。这些变化通常同时发生，共同加速复合乳液的不稳定［1］，复合乳液的不稳定进一步影响微球性质。有些包囊物如蛋白质趋向吸附于水-油界面，引起解折叠、失活以及不可逆的聚集;乳化过程高的剪切力还会影响包囊物结构及生物活性，这些都与制备过程的各种因素有关。总之，微球的最终性质，如大小分布、形态、载药量、包囊率、释放等都受制备过程包括囊壁材料性质、有机溶剂的选择及去除、水油相体积比、乳化时间等多种因素的影响［4-5］。

2 W/O/W复乳溶剂蒸发法制备水溶性药物微球的关键影响因素

2．1 囊壁材料

1988 年，Ogawa 等［6］首先以聚乳酸(PLA)，聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)为材料，通过W/O/W复乳溶剂蒸发法制备可注射利普安微囊，近20多年来，以该法制备水溶性药物的PLA、PLGA微球得到广泛应用，究其原因，PLA、PLGA具无毒、生物相容性好、可生物降解等优点，可制成不同载体运载多肽、疫苗、小分子等，美国食品与药品管理局已批准上市［7］。以该法制备PLA、PLGA药物微球也存在不可忽视的缺点，如聚合物降解产生的酸性环境可能引起包囊物变性;疏水性使一些包囊物吸附，导致包囊物聚集及释放不完全等。聚乙二醇(PEG)具显著的生物和物理化学性质，包括独特的立体稳定性、高度亲水性、链灵活性、电中性，缺乏功能团不能与体内生物成分反应［8］。因此研究者在PLA、PLGA单体乙交酯、丙交酯的基础上引入PEG片段，合成具不同组成及结构的AB型二嵌段共聚物，ABA、BAB型三嵌段共聚物(A具疏水性，B具亲水性)作为壁材，共聚物同时具生物相容性及两亲性可作为更好的载体。

Liu等［9］以W/O/W复乳溶剂蒸发法制备包囊肿瘤坏死因子受体阻断肽微球，PEG-PLGA作为囊壁材料。制备的微粒近圆形，表面光滑，无聚集现象;平均直径142～227 nm;包囊率大于45%;体外释放为二相性模式，相对稳定的释放达12 d以上;聚合物中PEG含量增加时，释放速度加快。结果显示PEG-PLGA微球具有较好的运载水溶性肽类的潜能。Xu等［10］在PLA的基础上引入PEG、甲氧基聚乙二醇(Me-PEG)，合成并比较了三嵌段共聚物PLEG和二嵌段共聚物MePLEG对微球粒径及包囊率的影响。微球粒径在纳米范围，分散性良好。二嵌段、三嵌段共聚物在乳化过程充当乳化剂，亲水、疏水基团分别延伸到水、油相，稳定乳液表面。推测二嵌段共聚物自乳化能力较强，PLEG三嵌段共聚物由于较大的立体位阻难以稳定乳液表面，因此MePLEG微球粒径比PLEG微球的小;PLEG微球的包囊率几乎都达90%以上，远大于MePLEG微球(79．54%和60．06%)，估计二嵌段共聚物结构在制备过程易引起包囊物渗漏到外水相。牛文强等［11］选用具较好生物降解性和相容性的三嵌段共聚物PLA/PEG/PLA(PELA)为壁材制备包囊胰岛素的微球，微球平均粒径为180～350 nm，圆形，大小均一，共聚物中PEG含量越低、共聚物浓度越高时微球的包囊率越高。

2．2 添加物

高能乳化(超声处理、均质处理等)是形成稳定乳液的常规方法，但同时也是破坏活性成分的主要原因，如处理过程活性成分与有机溶剂大面积接触、高的剪切力、产生的自由基团都会破坏活性成分。因此，实际操作中通常引入添加物作为保护性胶体帮助形成稳定乳液。

2．2．1 表面活性剂 W/O/W乳液两个热力学不稳定的W/O和O/W界面需不同的乳化剂稳定。低亲水-亲脂平衡值(HLB)表面活性剂相对亲油，在初乳化步骤稳定W/O初乳液，常用司盘系列;吐温系列是常用的外水相表面活性剂，其HLB值较高，相对亲水，因此加入外水相稳定W/O/W乳液，两种表面活性剂对微球性质有较大影响，在研究中通常联合使用［12］，寻找不同系列、不同浓度的优化组合。

Khoee等［13］制备青霉素G微球，在初乳化、复乳化阶段分别使用司盘、吐温作为表面活性剂，发现微球大小变化(75～638 nm)取决于表面活性剂类型及含量。吐温对微球粒径影响比司盘大，联合使用司盘60和吐温60，微球粒径显著小于司盘20和吐温20的组合。司盘主要密封内水相的青霉素G，吐温增加外水相黏度，防止青霉素G扩散到外水相，司盘和吐温含量增加，微球包囊率上升，突释下降。Zhu等［14］制备胰岛素微球，也分别使用司盘及吐温作为两个乳化步骤的表面活性剂进行类似研究。但较显著影响微球粒径的是司盘;粒径大小与加权HLB值成正比，联合使用司盘80和吐温80，其加权HLB值最小，粒径最小。吐温对载药率的影响大于司盘，司盘量恒定时，吐温含量上升，载药率快速上升;吐温恒定时，司盘含量上升，累积释药率下降。相同浓度条件下，联合使用司盘60和吐温60，载药量比联合司盘80和吐温80高，累积释药率比联合司盘80和吐温80低。

2．2．2 稳定剂 聚乙烯醇(PVA)低毒，具良好的双亲性，能提高水相黏度并吸附在水-油界面，是很好的乳化剂和稳定剂。通常加入到外水相作为稳定剂，增大外水相黏度和降低包囊物扩散速度进而影响微球形态及最终性质。

Liu等［15］研究了艾塞那肽PLGA微球的制备、特征及药效。发现微球粒径随外水相PVA浓度上升显著下降。PVA浓度1%～3%，外水相黏度增大，减少艾塞那肽由内水相向外水相的扩散，包囊率从76．1%上升到82．3%;PVA浓度增大到5%时，包囊率下降，推测PVA浓度升高时乳液液滴太小以至不能形成厚而致密的保护性聚合物囊壁，更多艾塞那肽扩散到外水相。Ayoub等［16］研究多种形成参数对复乳溶剂蒸发法包囊亲水性药物的影响。外水相采用0．5%PVA作为稳定剂，复合乳液最稳定，微球粒径在纳米范围内。Chaisri等［17］制备头孢氨苄微球，评价各制备因素对微球性质的影响以获得适合治疗奶牛乳腺炎的运载系统。其中外水相PVA浓度固定为2%，体积从10 mL增加到50 mL时，分散液滴的剪切力减小，微球直径从3．2 μm增大到4．8 μm，包囊率显著下降，原因是外水相体积增大，更多药物溶解其中。PVA相对分子质量从15 000上升到100 000，外水相黏度增大，稳定乳液液滴防止聚集，微球从4．95 μm降到3．17 μm;头孢氨苄的包囊率在 PVA相对分子质量为100 000时最大，但CPX的包囊率随相对分子质量增大上升不明显。

2．2．3 盐类和糖类 随着W/O/W复乳溶剂蒸发法技术的发展，在联合司盘和吐温作为表面活性剂、PVA作为稳定剂的基础上，添加适当浓度的盐类、糖类等来调节渗透压是维持乳液稳定，改善微球性质的有效策略。

Ito及其团队［18］结合SPG膜乳化技术制备蓝色葡聚糖PLGA微球，先得到均一W1/O初乳液，W2中添加NaCl，微粒表面因吸附了分子而产生的立体位阻促进乳液液滴的稳定，W1/O/W2复乳液滴随NaCl浓度增大而减小;但最后制得的微球随NaCl浓度上升而增大，且大于未添加NaCl的，这是加入的NaCl影响微球表面电势，微球表面双电层挤压的结果。因此，就制备乳液和聚合物微球而言，制备过程添加NaCl得到不同结果。NaCl抑制药物渗漏，载药率随NaCl浓度上升而增大。添加NaCl可加强对药物释放的控制，添加NaCl各组释放减慢。Jiang等［19］研究渗透压对包囊牛血清蛋白的PLGA微球大小、形态和释放等的影响。结果显示，外水相添加NaCl，有机溶剂挥发、聚合物固化变慢，形成更大更致密微球，内部小孔较少较小，与未添加NaCl相比，突释率从78．7%降至32．9%，包囊率上升。在外水相中添加蔗糖也得到类似结果，但效果稍差。推测NaCl除增加渗透压外，还存在不同的作用机制。NaCl能增加外水相极性，使有机溶剂在外水相中的溶解度变低，挥发变慢，形成较稠密的微球;蔗糖不存在这种电离作用，其突释降低(78．7%降至52．4%)仅通过渗透压的升高，因此效果不如NaCl的显著。在Benna-Zayani等［20］的研究中，硬葡聚糖、鹿角菜胶、黄原胶及刺槐树胶混合物的多糖水溶液作为外水相，通过阻止乳状沉淀或最终的聚集来稳定复乳液。结果显示除鹿角菜胶水溶液不存在屈服应力外，硬葡聚糖、黄原胶及刺槐树胶混合物的水溶液都具有相对低的屈服应力和塑性黏度，剪切后能迅速还原为原先的拟三维网状结构，该流变学性质使复合乳液制备容易，还可通过防止油滴乳状沉淀使其得以悬浮在外水相中。其中硬葡聚糖水溶液制备的乳液最稳定，两年后无沉淀现象，液滴粒径最小。

2．3 溶剂的选择

以W/O/W复乳溶剂蒸发法制备微球，通常采用蒸发法或萃取法去除有机溶剂。常使用的有机溶剂包括二氯甲烷(DCM)、乙酸乙酯(EA)和丙酮(ACE)等，通常单独使用一种或联合使用。

Ravi等［21］根据有机溶剂水溶性，溶解聚合物的能力分别选择ACE、EA、DCM作为有机溶剂，其水溶性ACE＞EA＞DCM。结果显示，微球大小显著受有机溶剂水溶性的影响，高水溶性有机溶剂制备的微球大，原因在于高水溶性有机溶剂迅速扩散到水相时，聚合物不规则聚集;DCM微球较小，可能是DCM对PLGA有较好的溶解性，形成致密微球。有机溶剂挥发伴随聚合物固化，低水溶性有机溶剂促进蛋白质分配到水相，包囊率较高;高水溶性有机溶剂因聚合物不规则聚集，包囊率低。

ACE在单独使用的基础上，常作为DCM的共溶剂。Chaisri等［17］还探讨了有机溶剂对头孢氨苄微球性质的影响，添加ACE到DCM中作为共溶剂，ACE溶于DCM并提高其水溶性，因此外水相可快速抽提有机溶剂，由于快速抽提，有机相和外水相之间发生界面湍动现象，形成小粒子，制备的微球减小。Qi等［22］在包囊过氧化氢酶时，探讨不同有机溶剂对酶活性的影响。发现，ACE与DCM的比例为1∶1，过氧化氢酶的活性比单独将EA和DCM作为有机溶剂时高。

2．4 内水相与油相的体积比

内水相与油相的体积比(Vw1/VO)也是影响微球性质的关键因素。Lu等［23］发现，Vw1/VO是控制微球中空结构的关键因素之一。Vw1/VO从0．13上升至0．53，越来越多中空微球出现，中空率在0．53时达峰值，继续上升，许多微球破裂。中空度及微球大小随体积比增大先上升后下降，推测W1体积较小，形成的水滴较少较小，油相难以抓住水滴，得到小而结实的微球;W1体积增大，油相能抓住液滴，溶剂挥发后最终形成中空微球，微球较大，但W1继续增大会引起聚合物沉淀在W1/O界面，微球结构被破坏。Takei研究小组［24］包囊乳酸菌(LAB)，以LAB活性为指标优化制备工艺。发现，Vw1/VO低于 0．5 成功制得微球，比例升高到0．56和0．66，W1/O初乳液在W2中不稳定，溶剂挥发过程微球聚集，LAB活性在比例为0．1时最高。蒋涛等［25］制备单唾液酸四己糖神经节苷酯PLGA微球并进行优化。发现Vw1/VO增大，可提高载药量，但比例继续增大，初乳微球稳定性及载药量降低，Vw1/VO为1∶10 较为合适。

3 结语及展望

W/O/W复乳溶剂蒸发法制备工艺依赖多种因素，除上述影响因素外，还包括乳化方法及时间、搅拌速度、外水相体积等，对这些变量综合考虑可制备较理想的水溶性药物微球。就文献报道看来，目前该研究主要以微球大小、形态、载药量、包囊率、体外释放等为指标优化制备工艺并取得较大进展。工艺优化除考虑影响因素外，还可在已有研究［18，26］基础上进一步发展该法与SPG膜乳化技术相结合控制粒径，提高包囊率;根据水溶性药物性质或具体应用设计合成聚合物壁材可能更具适用性及针对性等等。本实验室研究发现仙人掌多糖具显著的降血糖降血脂等功效［27-28］，但多糖易吸湿，其制剂有效期短，功效难以发挥。为解决以上问题，我们曾以交联法制备包囊仙人掌多糖的明胶微球，但释放快;现阶段以W/O/W复乳溶剂蒸发法制备包囊仙人掌多糖的PLGA微球，得到的微球圆整性好，分布均一，包封率较好。

除制备工艺优化的文献报道，近年来大量研究以动物及体外实验探讨药物微球的疗效及毒副作用［29-30］，但鲜见作用机理、药动学、量效关系、最优剂量等方面的研究，疗效、毒副作用还有待更进一步的探讨。以W/O/W复乳溶剂蒸发法制备水溶性药物微球要进行临床试验及引入市场还需更先进的技术及深入研究。相信随着研究的推进，以W/O/W复乳溶剂蒸发法制备水溶性药物微球将更多地用于实际，有广阔的发展前景。

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Research progress on preparation of water-soluble drug microspheres by W/O/W multiple emulsion solvent evaporation method

YUAN Qing-xia1，2，ZHAO Long-yan1，CHENG Jie1，2，ZENG Fu-hua1
(1．School of Life Science and Technology，Zhanjiang Normal University，Zhanjiang 524048，China;2．School of Biological Science and Technology，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China)

R944．9;TQ460．6

A

1005-1678(2012)06-0920-04

2012-04-28

广东高校边缘热带特色植物工程技术开发中心开放基金(NO．［2012］0103); 湛江市科技计划项目(No．2011D032)

袁清霞，女，硕士研究生，研究方向:多糖开发利用及其剂型研究;曾富华，男，通信作者，博士生导师，从事植物天然产物的开发与利用，Tel:0759-3183140，E-mail:zengfuhua@gmail．com。