芥子碱对Aβ25-35诱导的认知功能障碍小鼠海马神经元再生的影响

宋贵军，林璐璐，李 昱，曹云鹏

(1.大连医科大学 附属第二医院 神经内科，辽宁 大连 116027;2.中国医科大学 附属一院 神经内科，辽宁 沈阳 110001)

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一种常见的神经系统退行性疾病，主要特征为进行性认知功能障碍［1］。新生神经元未能替代病变神经元是影响AD预后的关键因素。海马在AD患者病程发展中具有重要作用，而该部位的神经元再生情况是治疗AD患者的重要靶点［2-3］。芥子碱(sinapine，3.5-二甲基，4-羟基苯丙烯酰胆碱)是广泛存在于十字花科植物中的酚类小分子生物碱，具有抗氧化、抗衰老、抗辐射等多种生物学功效［4］。研究表明，芥子碱可改善AD大鼠的学习和记忆障碍，并可改善海马胆碱功能缺失，提示芥子碱是可用于AD的治疗［5］。但目前对芥子碱能否促进AD的海马神经元再生及改善相关指标水平尚不清楚，因此本研究给予Aβ25-35诱导的认知功能障碍小鼠芥子碱处理，观察对海马神经元再生及相关指标的影响，为AD的治疗提供依据。

1 材料

芥子碱(纯度＞93%)，上海酶联生物科技有限公司;Aβ25-35、二甲亚砜(DMSO)、TritonX100，美国Sigma公司;β-actin、辣根过氧化物酶(HRP)标记鼠二抗、兔二抗单克隆抗体，美国Santa Cruz公司;海马生长相关蛋白43(GAP-43)和突触素(P38)多克隆抗体，美国Cell Sigaling Technology公司;BCA蛋白分析试剂盒，碧云天生物科技公司;TUNEL显色试剂盒，Roche公司;丙二醛(MDA)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和超氧化物歧化酶(SOD)活性试剂盒，南京建成生物工程研究所。

健康雄性ICR小鼠，体重25～30 g，购于北京维通利华公司，合格证号:SCXK(京)2011-0034。

2 方法

2.1 Aβ25-35小鼠模型制备

采用侧脑室内注射Aβ25-35诱导认知功能障碍小鼠模型:将Aβ25-35肽段溶于水中，终浓度为3 mmol/L，封口膜封口后于37℃水浴中孵育96 h。腹腔注射2%水合氯醛溶液(10～20mL/kg)麻醉小鼠，将其固定于脑立体定位仪上。行颅顶正中切开，暴露颅骨，以前囟点为坐标，前囟点后0.3 mm，右侧1 mm，深2.5 mm为侧脑室注射坐标，缓慢注射Aβ25-35溶液5 nmol(1.7μL)，留针3 min，保证溶液充分进入侧脑室。而假手术组则注射生理盐水1.7μL，其余操作步骤与Aβ25-35组一致。术毕缝合皮肤。

2.2 分组及给药

将小鼠分为4组:假手术组、Aβ25-35组、假手术+芥子碱组和Aβ25-35+芥子碱组，每组各10只。Aβ25-35组和Aβ25-35+芥子碱组为采用侧脑室内注射Aβ25-35诱导的认知功能障碍小鼠，其余两组为正常小鼠;假手术+芥子碱组和Aβ25-35+芥子碱组于术后灌胃给予芥子碱30mg/kg，1次/d，连续3周，其余两组给予等体积的水。

2.3 学习记忆功能检测

采用Y型电迷宫法检测学习和记忆功能。小鼠在电压(70 mV)电击足部，向三等分辐射式反射箱逃避，反射箱的三个手臂顶端均有信号灯，且灯亮时则示意此臂安全无电。造模后1周将小鼠放入Y型电迷宫内让其适应环境，当小鼠由电击区域逃至不通电区域时为正确反应。记录每组的学习成绩(连续10次中有9次正确反应所需要的电击次数)和记忆成绩(连续10次测试中的正确反应次数)。

2.4 细胞凋亡指数

过量麻醉法处死小鼠，迅速断头取脑，采用预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)清洗干净，置于液氮中至适当硬度;取出固定后的鼠脑，选择海马CA1区，用冰冻切片机进行冠状连续切片，脑片厚度为40μm，每隔200μm取1张，每只小鼠取12张脑片。采用TUNEL试剂盒进行脑片染色，采用显微镜观察形态，于每组随机选取5个高倍镜视野，分别计数凋亡细胞数和总细胞数，并计算凋亡指数。

2.5 ELISA法检测海马 MDA、TNF-α 水平和SOD活性

取海马组织，于冰上研磨并裂解15 min;12 000 r/min离心20 min，收集上清，并分别采用MDA、TNF-α和SOD试剂盒来检测相应指标，操作步骤依据试剂盒说明书。

2.6 Western blot实验

取海马组织，加入全蛋白提取缓冲液0.5mL于冰上裂解15 min;12 000 r/min离心20 min后，取上清并采用BCA法测定蛋白浓度。将蛋白样品与加样缓冲液混合，取等量蛋白加样并行10%SDSPAGE凝胶电泳。电泳条件:浓缩胶恒压80 V约20 min，分离胶100 V约80 min。半干转至PVDF膜，按约0.1mL/cm2的量加适量一抗，GAP-43和P38Akt的稀释比例为分别为1∶200和1∶400。4℃孵育过夜。TBST漂洗PVDF膜，加入二抗(稀释比例1∶3 000)室温下摇荡孵育2 h，然后用TBST充分洗膜。采用ECL法来显色处理，胶片曝光后观察蛋白的条带，并采用Gel-Pro analyzer分析各显影条带的光密度，蛋白相对表达量为与β-actin的比值。

2.7 统计学处理

3 结果

3.1 芥子碱对Aβ25-35诱导的认知功能障碍小鼠学习记忆功能的影响

Aβ25-35组的学习次数多于假手术组，记忆次数少于假手术组(P＜0.05)，而芥子碱处理可改善Aβ25-35诱导引起的学习次数增多和记忆次数减少(P＜0.05)，但仍与假手术组有差异(P＜0.05);芥子碱处理对假手术组的学习记忆功能无影响，见表1。

表1 4组小鼠的学习和记忆情况

3.2 芥子碱对Aβ25-35诱导的认知功能障碍小鼠海马CA1区神经元凋亡的影响

Aβ25-35组海马CA1区神经元凋亡率为(39.48±5.78)%，高于假手术组的(0.95±0.32)%(P＜0.05);而Aβ25-35+ 芥子碱组为(22.83±6.57)%，可见，芥子碱处理可改善Aβ25-35诱导引起的CA1区神经元凋亡率升高，但仍与假手术组有差异(P＜0.05);假手术 + 芥子碱组为(0.87±0.41)%，可见，芥子碱处理对假手术组的CA1区神经元凋亡率无影响。TUNEL染色图见图1。

图1 芥子碱对对海马CA1区神经元凋亡的影响

3.3 芥子碱对Aβ25-35诱导的认知功能障碍小鼠海马MDA、SOD和TNF-α的影响

Aβ25-35组的MDA和TNF-α水平高于假手术组，SOD活性低于假手术组(P＜0.05)，而芥子碱处理可改善 Aβ25-35诱导引起的MDA和TNF-α水平升高，SOD活性降低，但仍与假手术组有差异(P＜0.05);芥子碱处理对假手术组的海马MDA、SOD和TNF-α水平无影响，见表2。

3.4 芥子碱对Aβ25-35诱导的认知功能障碍小鼠海马GAP-43和P38的影响

Aβ25-35组的GAP-43和P38蛋白水平均低于假手术组(P＜0.05)，而芥子碱处理可改善Aβ25-35诱导引起的GAP-43和P38蛋白水平降低，但仍与假手术组有差异(P＜0.05);芥子碱处理对假手术组的海马GAP-43和P38蛋白水平无影响，见表3。Western blot结果见图2。

表2 4组小鼠海马的MDA、SOD和TNF-α水平比较

表3 4组小鼠海马的GAP-43和P38水平比较(相对光密度)

图2 芥子碱对海马GAP-43和P38蛋白的影响

4 讨论

芥子碱是广泛存在于十字花科植物中的一种酚类小分子生物碱，具有多种生物功能，如抗氧化、抗辐射、抗炎、抗衰老等［4］。近期研究表明，芥子碱可改善痴呆大鼠的乙酰胆碱功能缺失，并改善学习功能障碍［5］，提示其在治疗AD中具有较好的应用前景。

本研究结果表明，Aβ25-35处理可导致小鼠的学习和记忆功能障碍，主要与侧脑室注射Aβ25-35可引起神经系统退化有关，如突触丢失、神经元变性、学习记忆能力受损［6］。而芥子碱处理可改善Aβ25-35诱导引起的学习记忆障碍，但仍与假手术组有差异，表明芥子碱可改善Aβ25-35诱导的认知功能障碍小鼠的学习和记忆损伤。此外，本研究还发现Aβ25-35处理的海马神经元凋亡增多，表明Aβ25-35诱导的认知功能障碍小鼠的神经再生受到抑制，也是Aβ25-35处理的小鼠出现学习和记忆功能障碍的主要原因。芥子碱可降低Aβ25-35诱导的海马神经元细胞凋亡率增加，提示其对改善Aβ25-35诱导的认知功能障碍小鼠海马区神经再生有一定的促进作用。

氧化应激导致的自由基损伤可影响AD的治疗效果，而MDA、TNF-α水平和SOD活性是评价氧化应激的常用指标。GAP-43是神经元生长发育和神经可塑性的首选分子探针［7］，P38是评价海马神经元突触发育过程中的常用指标［8］。因此，采用以上指标来评价芥子碱处理对海马分子指标的影响，发现芥子碱处理可改善Aβ25-35诱导的认知功能障碍小鼠海马区以上指标的异常，表明其可改善海马氧化应激水平，并促进神经的再生。以上指标的变化提示降低氧化应激水平、促进突触发育和神经可塑是芥子碱发挥认知障碍保护作用的可能机制。

综上所述，芥子碱可改善Aβ25-35诱导的认知功能障碍小鼠的学习记忆功能障碍，降低海马神经元凋亡，并缓解海马区与神经再生相关蛋白及分子的水平。

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