透明质酸应用于干细胞培养的研究进展

李 强，郭学平，2，张天民

(1．山东大学 药学院，山东 济南 250012;2．山东福瑞达生物医药有限公司，山东 济南 250101;3．山东省生物药物研究院，山东 济南 250101)

透明质酸应用于干细胞培养的研究进展

李 强1，郭学平1，2，张天民3

(1．山东大学 药学院，山东 济南 250012;2．山东福瑞达生物医药有限公司，山东 济南 250101;3．山东省生物药物研究院，山东 济南 250101)

透明质酸是一种广泛存在于细胞基质中的大分子酸性黏多糖，是一种重要的细胞外基质成分，具有良好的生物相容性和力学特性，体内可自行降解，同时通过与细胞表面受体结合，直接影响组织构建，促进细胞迁移以及胞外基质重构。研究表明透明质酸具有影响体外培养干细胞的黏附、迁移、增殖、老化及分化的能力。本文对透明质酸用于干细胞培养的最新研究进展进行综述。

透明质酸;干细胞;细胞培养;组织工程

透明质酸(hyaluronic acid，HA)，又名玻璃酸，是由D-葡糖醛酸(GlcA)和N-乙酰氨基葡糖(GlcNAc)二糖单位通过β-1，3或β-1，4糖苷键连接而成的线性高分子酸性黏多糖［1］。HA是构成细胞外基质(ECM)和细胞间基质(ICM)的主要成分，是皮肤、玻璃体、关节滑液和软骨组织的重要组成成分，具有独特的理化性质和生物功能［2］。它具有良好的润滑性、黏弹性，并可通过与细胞表面受体结合，引发一系列生理生化反应，从而影响细胞的黏附、增殖、分化和移动。HA及其衍生物具有优良的生物相容性和可降解性，可作为药物媒介和组织工程材料，广泛应用于生物医学领域［3］。在过去的十年，HA作为创建新型材料的组成部分用于细胞治疗、三维细胞培养以及组织工程方面日益得到研究者的重视［4-7］，有关HA应用于干细胞培养以及组织工程材料的研究逐年增多。

干细胞是指具有自我复制能力，可经过不可逆的终末分化过程产生子代细胞的细胞，可以通过各种子代细胞、前体细胞的分化过程产生多种细胞表型［8］。根据细胞来源可将干细胞分为胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESC)和成体干细胞(adult stem cell)。干细胞有着巨大的医学应用前景，有可能作为“种子细胞”用于细胞替代疗法，以治疗各种难治性疾病。但是，干细胞经体外长期培养后，其增殖活性和分化能力都会有所降低。如何使干细胞在体外不断增殖的同时维持着不分化的状态和分化的潜能以及如何诱导其向特定细胞类型分化，是将其用于临床必须解决的问题。近年来研究表明，HA对体外干细胞培养有着十分重要的影响，展示了广阔的应用前景。

1 HA应用于ESC培养

ESC是存在于早期胚胎组织中，具有高度增殖能力和多向分化潜能，能分化为三个胚层所有细胞类型的原始细胞。三维多孔的培养环境能有效地诱导ESC的定向分化，促进细胞间的相互作用，截留细胞分泌的ECM，同时有利于维持细胞的球形形态。HA水凝胶可以为细胞生长提供疏松多孔的三维结构，同时还能与细胞表面受体结合，调节胚胎干细胞的分化［9］。

Gerecht等［10］研究了HA水凝胶对ESC增殖与分化的影响，发现HA与ESC保持未分化状态有重要联系。在传统干细胞培养基质中加入HA水凝胶，不仅可以维持ESC长期的体外增殖能力和未分化状态，还能维持其遗传完整性。向凝胶中加入透明质酸酶水解一定时间后，ESC从凝胶中完全释放出来，在条件培养基培养一段时间后转入加入了血管内皮生长因子的培养基中培养。细胞开始表现分化的状态，显示血管α-平滑肌肌动蛋白阳性，部分细胞呈早期内皮细胞标记CD34受体阳性，说明ESC保持其分化的能力。

不同相对分子质量(Mr)的HA对体外培养ESC全能性的保持以及增殖能力有不同的影响。Joddar等［11］研究发现，相对于高Mr(1 000×103)HA，低Mr(4～8×103)HA更有利于维持体外培养的小鼠ESC的存活及其未分化状态。

2 HA 应用于成体干细胞培养

成体干细胞指存在于各组织器官的未分化细胞，在体内具有终生自我更新能力和分化潜能，且具有可塑性和横向分化的特性。HA作为ECM的组成部分，具有良好的生物相容性，可作为各种干细胞体外培养的基质。同时，HA支架具有良好的结构和机械性能，在体内可自行降解，在组织工程材料方面有广泛的应用前景。

2．1 HA应用于间充质干细胞培养

间充质干细胞是具有自我增殖能力以及分化成多种细胞系的多功能干细胞，在不同的培养基、生长因子等因素的诱导下可分化为骨细胞、软骨细胞、成纤维细胞、肌细胞、神经细胞、脂肪细胞等中胚层来源细胞。近年来，HA作为非合成生物材料主要用于创建控制间充质干细胞行为及向软骨形成方向分化的媒介和微环境。

寇建强等［12］向兔骨髓间充质干细胞培养液中分别加入HA诱导液、软骨诱导液和常规培养液，经培养后发现经HA诱导后，细胞增殖速度减慢，表现出软骨细胞的分化特点，但比软骨诱导液的诱导能力弱。因此HA可作为软骨组织工程基质使用，可促进骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化。Chung等［13］发现在短期体内及体外培养中光致交联的HA凝胶相比于惰性的聚乙二醇凝胶更能促进软骨基质蛋白的表达，同时转化生长因子β-3容易在HA水凝胶中传递以调节凝胶中间充质干细胞的基因表达。

Garcia-Fuentes等［14］将丝心蛋白和HA的水溶液冷冻干燥后加入甲醇使其形成多孔微观结构的支架，其中HA作为优良的致孔赋形剂使丝心蛋白支架在原制作工艺的基础上更容易形成多微孔结构。将间充质干细胞接种于该蚕丝蛋白/HA支架培养3周，发现对比丝心蛋白支架，该支架明显促进细胞向支架内生长。在培养过程中加入组织诱导刺激物，通过检测黏多糖和I型和Ⅱ型胶原基因的表达，表明该新型支架可有效促进组织形成。

2．2 HA应用于神经干细胞培养

细胞移植是中枢神经系统紊乱如帕金森病等的潜在治疗方法，然而治疗效果常被移植细胞较低的生存能力所限制。近年来，研究了HA对神经干细胞生长的影响，以期提高其生存能力并有助于诱导其分化。Zhang等［15］将神经干细胞离体培养于加入了神经营养蛋白3的HA-胶原复合材料中，并将5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记的神经干细胞导管植入到横切的兔面神经末端，肌电图扫描结果表明HA-胶原复合材料可以促进损伤面神经的修复。人造神经干细胞导管将有可能应用于末梢神经损伤的治疗。而Wang等［16］通过冷冻干燥将HA与胶原蛋白混合制成HA-胶原蛋白支架，然后与水溶性的碳化二亚胺交联以提高其机械稳定性，从而制得一种类似于脑组织的具有开放多孔结构以及相似机械特性的复合材料。他们将神经干细胞经体外扩大培养后植入该复合材料中，发现该材料在体外可促进神经干细胞向神经元细胞的分化。

2．3 HA应用于脂肪干细胞培养

脂肪组织在体内储量丰富，有较强再生能力，取材创伤小，细胞可大量获取。鉴于以上优势，脂肪来源的干细胞有望成为组织工程“种子细胞”之一，用于组织的重建、修复以及医疗美容等［17-18］方面。

Wu等［19］尝试将脂肪干细胞培养于HA覆盖的培养平板和HA/乳酸-羟基乙酸共聚物(HA/PLGA)支架中。研究结果显示，脂肪干细胞在HA覆盖的培养孔板中培养24 h后，细胞聚集体和相关mRNA表达量明显增加，培养9 d后，黏多糖硫酸盐含量也显著提高。HA/PLGA没有改变细胞黏附和存活，与PLGA支架相比，软骨形成标记基因的mRNA表达量、黏多糖硫酸盐和Ⅱ型胶原蛋白水平明显提高。因此，HA富集微环境有利于人脂肪干细胞分化成软骨。

Flynn等［20］将人脂肪干细胞培养于胎盘去细胞基质(PDM)和交联HA支架中，在诱导其分化之前检测细胞增殖、存活水平和葡萄糖的消耗量，并通过终点与实时反转录聚合酶链反应检测其基因表达进而分析不同支架中脂肪形成的程度。结果显示，细胞黏附的PDM支架促进细胞的增殖和存活能力，而非黏附性的XLHA则明显提高细胞的分化能力。

2．4 HA应用于肝干细胞培养

从胎儿肝脏分离出的肝细胞、肝干细胞以及肝祖细胞体外培养前后均发现CD44受体的表达。这预示着其与HA存在着某些体内联系，为HA制备成的3D支架应用于肝干细胞体外培养及分化提供了可能。Turner等［21］将肝祖细胞于加入了HA水凝胶的无血清已知成分培养基中培养。经过4周的培养，在凝胶中形成细胞团块并保持细胞的存活、增殖，表现出一种介于肝干细胞和成肝细胞之间的一种细胞表型，同时有少许证据显示其限定于向肝或胆的分化方向。Lozo-ya等［22］进一步研究发现，人肝干细胞的分化方向决定于加入了HA水凝胶的培养基的硬度，该HA水凝胶与Kubota培养基(Kubota's medium)组成的培养系统很好的模拟了干细胞在体内的3D生长环境，不仅支持肝干细胞的黏附、生存以及扩增，同时还能通过改变其机械硬度调节肝干细胞向多种肝祖细胞的分化方向。因而，HA水凝胶可作为肝干细胞理想的3D支架，在生产用于生物人工肝或组织工程肝的细胞方面有较大应用前景。

3 结语与展望

在过去的十年中，应用于组织再生的具有合适的架构、分子大小可调，起临时支撑作用的生物可降解大分子化合物的研究得到快速发展。与此同时，随着干细胞的不断深入研究及其广泛的应用前景，对干细胞的体外培养提出更高的要求。HA作为人体组织ECM的重要组成部分，具有良好的生物相容性，广泛应用于生物医学领域中的传递系统、细胞封装和组织工程，基于HA的合成胞外基质经过浓度、组成以及结构特性的优化，可更广泛的应用于干细胞培养［23-24］。

HA在其单一溶液中的物理和生物特性，如水溶性、快速吸收以及较短的组织停留时间，限制了其作为生物材料的应用，因此可尝试修饰HA结构以改变其物理化学性质或将HA与其他生物材料共同使用，扩大其在生物医学等领域的应用。

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Advances in research of applying hyaluronan to stem cell culture

LI Qiang1，GUO Xue-ping1，2，ZHANG Tian-min3
(1．School of Pharmaceutical Science，Shandong University，Jinan 250012，China;2．Shandong Freda Biopharm Co．，Ltd．，Jinan 250101，China;3．Institute of Biopharmaceuticals of Shandong Province，Jinan 250101，China)

R966

A

1005-1678(2012)06-0930-03

2012-03-20

李 强，男，硕士研究生，制药工程学专业;郭学平，男，通信作者，研究员，硕士生导师，从事微生物与生化药学研究，Tel:0531-82685555，E-mail:guoxp@fredabiopharm．com．cn。