长效胸腺五肽的合成

史 敏，马亚平，倪京满

(1.兰州大学 药学院药剂学研究所，甘肃 兰州 730000;2.深圳翰宇药业有限责任公司，广东 深圳518057)

长效胸腺五肽的合成

史 敏1，马亚平2，倪京满1

(1.兰州大学 药学院药剂学研究所，甘肃 兰州 730000;2.深圳翰宇药业有限责任公司，广东 深圳518057)

目的 提高长效胸腺五肽(mPEG(10kD)-TP5)——定位单链聚乙二醇化修饰的胸腺五肽的合成产率。方法 选用Fmoc-Tyr(tBu)-Wang树脂和Fmoc/t-Butyl策略完成所有氨基酸的缩合，三氟乙酸对Wang树脂、侧链切割脱除。在碱性条件下，单甲氧基聚乙二醇修饰物(mPEG(10kD)-SPA)定点连接到赖氨酸的侧链氨基(ε-NH2)上。中间产物经钯碳催化氢化，得到mPEG(10kD)-TP5。结果 目标产物总收率为20%，新合成路线比我们之前报道的方法产率提高了10倍。结论 路线操作简单，易于纯化，产率较高。

胸腺五肽;定点聚乙二醇化;合成

胸腺五肽(Thymopentin，TP5)是人工合成小分子多肽，其氨基酸序列为NH2-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-COOH，保持了内源性胸腺生成素Ⅱ调节机体免疫平衡的生物活性，其原型药物体内半衰期仅为30 s［1］。多肽或蛋白质药物进入人体后很快由蛋白酶和氨肽酶降解，此类药物经聚乙二醇化后可大大改善药物的溶解性以及在体内半衰期短、稳定性差、毒性大、免疫原性等问题［2］。蛋白质或多肽分子中大多存在多个氨基，可修饰位点随机。随机修饰方法对某些蛋白质多肽药物的改善并不能达到预期的效果，修饰后成分复杂、分离困难、药物活性大大下降、有效成分少［3］。TP5的构效关系表明，其活性位点为1位Arg和3位Asp，聚乙二醇修饰剂可修饰位点为1位 Argα-NH2和2位 Lys的 ε-NH2［4-5］。为了不影响母体药物TP5的活性，我们采用对TP5 Lys的ε-NH2进行定点修饰的方法，进行长效TP5的合成，我们前期报道的合成路线合成mPEG(5kD)-TP5方法产率仅为 2%［6］，且由于采用 mPEG(5kD)的 PEG，修饰产物体外血浆半衰期的延长效果不很理想。

本研究采用相对分子质量(Mr)为10 kD单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯(mPEG-SPA)为修饰剂，对TP5的Lys的侧链氨基(ε-NH2)进行修饰，初步活性试验显示合成目标化合物在提高合成产率的同时，体外生物活性也得到保持(将另文发表)。本文报道该长效胸腺五肽修饰产物的合成工作。该产物的体内生物活性及安全性评价研究正在进行中。合成路线见图1。

图1 mPEG(10kD)-TP5合成路线示意图Fig.1 Synthetic pathway of the mPEG(10kD)-TP5

1 材料

1.1 原料与试剂

mPEG-SPA(10kD)购自北京凯正科技有限公司;Fmoc-Tyr(tBu)-Wang树脂(1%交联度，100～200目，S(基团负载量)=0.3 mmol/g)购自天津南开和成科技有限公司;所用氨基酸均为L型，购自上海吉尔生化;N，N-二甲基甲酰胺(DMF)用A4分子筛干燥;二氯甲烷(DCM)经无水碳酸钾干燥;无水甲醇(MeOH)经A4分子筛干燥;无水乙醚经金属钠干燥;哌啶经氢氧化钾干燥;二异丙基乙胺(DIEA)直接使用;用茚三酮显色法(Kaiser法)检测缩合反应。

1.2 仪器

VirTis bencbtopK冻干机;Watars 600型高效液相色谱仪;Watars2996检测器;Watars Delta 600泵;Waters Delta-Pak C18柱(3.9 mm ×150 mm)分析柱;Waters Delta-PakC18柱(19 mm×250 mm)半制备柱;BRUKER 300M核磁检测仪。

2 方法

2.1 合成中间产物Ⅰ

将 Fmoc-Tyr(tBu)-Wang 树脂 1.5 g(0.45 mmol，1 eq)于 DCM 中溶胀30 min，DMF 洗涤(3 min×3)，用体积分数为20%的哌啶 DMF溶液脱除Fmoc保护基25 min，DMF洗涤树脂(3 min×3)，取少许树脂用Kaiser法检测，显蓝色。取FMOC-Val-OH 458 mg(1.35 mmol，3 eq)、苯并三氮唑-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)512 mg(1.35 mmol，3 eq)、1-羟基苯并三唑(HoBt)183 mg(1.35 mmol，3 eq)依次溶解于 DMF，加入 DIEA 446 μL启动反应后，将体系加入固相合成仪中，室温反应1 h，体系用氩气保护。用DMF洗涤(3 min×3);茚检试剂检测无色。至此一个循环完成。循环以上步骤，按TP5的从C端到N端的顺序依次将FMOC-Asp(oBzl)-OH 601 mg(1.35 mmol，3 eq)、FMOC-Lys(BOC)-OH 633 mg(1.35 mmol，3 eq)、Z-Arg(NO2)-OH 477 mg(1.35 mmol，3 eq)偶联到树脂上。合成后树脂依次用DCM(3 min×2)，MeOH(3 min×1)洗涤;再用 DCM(3 min×1)，MeOH(3 min×2)洗涤。移开搅拌器将上一步得到的树脂用真空泵抽2 h，加入切割试剂三氟乙酸-双蒸水-三异丙基硅烷(95∶2.5∶2.5)10 mL，0 ℃反应 4 h，每 20 min 搅拌 1 min。收集切割剂，室温下真空旋干溶剂，加入冷乙醚40～60 mL，沉淀出白色固体。白色固体物用20%冰醋酸溶解，乙醚层用20%冰醋酸萃取，少量多次，合并20%冰醋酸溶液冻干后得粗肽;粗肽依次用葡聚糖凝胶(G25)粗处理，后用半制备高效液相色谱进行纯化制备，得纯品 253.2 mg(0.27 mmol)，产率为59.35%，得到中间产物Ⅰ结构为ZArg(NO2)-lys-Asp(oBzl)-Val-Tyr，ESI-MS［M+H］+949.6(图2)。

图2 中间产物Ⅰ质谱图Fig.2 Mass spectrometry of the intermediateⅠ

2.2 合成中间产物Ⅱ

单甲氧基聚乙二醇修饰物(mPEG-SPA(10kD))连接到Lys的侧链氨基(ε-NH2)上，取中间产物Ⅰ94.8 mg(5 eq，0.1 mmol)和 mPEG-SPA(10kD)200 mg(1 eq，0.02 mmol)溶解在体系氯仿-二氧六环-DMF(1∶4∶1)中，缓慢滴加 DIEA，使反应体系 pH 为 9.0。室温反应24 h后，减压抽干。产物加水溶解，过滤掉水不溶物，水透析48 h(截留Mr∶10 000)，冷冻干燥得白色粉末。采用反相高效液相色谱(RPHPLC)进行进一步纯化制备，得纯品 107.4 mg(0.01 mmol)，产率为49%。中间产物Ⅱ结构式为Z-Arg(NO2)-lys(mPEG)-Asp(oBzl)-Val-Tyr(图3)。1HNMR(300 MHz，D2O)，δ(ppm):δ7.40-7.33(m，10H，Ph)，7.09(d，2H，J=9Hz，Ph)，6.78(d，2H，J=9Hz，Ph)，4.24(d，2H，J=8.4Hz，tyr，lys 上的 ＞ CH-)，3.69(m，1001H ，PEG-H)，0.83-0.77(m，6H ，CH(CH3)2) 。

图3 中间产物Ⅱ结构式Fig.3 Structure of the intermediateⅡ

2.3 合成 mPEG(10kD)-TP5

中间产物Ⅱ55 mg(5μmol)溶于无水甲醇中，钯碳(Pd/C)催化氢化。目标产物采用半制备HPLC制备，得纯品 mPEG(10kD)-TP5 为 37.4 mg(3.4 μmol)，产率为68%，目标产物的终产率为20%。合成的mPEG(10kD)-TP5经核磁共振H谱，基质辅助激光解析质谱(图4)和氨基酸测序进行结构鉴定。因PEG为聚合物，Mr为平均值，则目标产物的Mr( ±1.6%)范围应为10 880.1 ～11 233.9，由图4 在11 057附近有一系列峰，相邻峰Mr相差44的倍数，具有 PEG的典型结构特征。1HNMR(300MHz，D2O)，δ(ppm):δ7.1(d，2H，J=6Hz，Ph)，6.79(d，2H，J=9Hz，Ph)，3.67(m，1013H，PEG-H)，0.83-0.79(m，6H ，CH(CH3)2)，判断产物的结构为 HArg-Lys(mPEG(10kD))-Asp-Val-Tyr-OH(图5)。

图4 mPEG(10kD)-TP5的MALDI-TOF-MSFig.4 MALDI-TOF-MSof mPEG(10kD)-TP5

图5 mPEG(10kD)-TP5结构式Fig.5 Structure of PEGylated(10kD)-TP5

3 讨论

在中间产物Ⅰ的合成过程中，对单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯可修饰的位点Arg侧链采用NO2保护，N端采用Z保护，而Lys的侧链采用BOC保护，因此在冰浴条件下采用三氟乙酸对Lys的侧链BOC基进行选择性脱除及切割树脂而不会裸露1位Arg的α-NH2和Arg侧链的NH2。这种正交保护策略避免了聚乙二醇修饰位点的随机性［7］。我们以往的合成方法［6］是在已缩合有Lys(PEG)高分子的Wang树脂上进行反复缩合脱除Fmoc等操作。由于Wang树脂作为载体高分子和PEG(5kD)高分子之间的空间位阻过大，而脱除Fmoc受空间位阻条件的限制，导致脱除FMOC单元很难进行，氨基酸缩合反应也很难进行，得到聚乙二醇化TP5也只有2%的产率。本研究采用更大Mr的PEG(10kD)修饰剂，合成的终产率为20%，比文献报道的用PEG(5kD)的产率提高了10倍。

用Mr大于20 kD的PEG修饰蛋白药物会导致药物丧失绝大部分的生物活性［8］，本研究采用低Mr(＜20 kD)的PEG修饰，mPEG(10kD)-TP5初步活性试验显示保持母体生物活性，其安全性评价研究正在进行中。

本研究的合成方法克服了原有的技术空间位阻大，产率低的缺点，同时为更多小分子肽类药物进行更高分子量的PEG以及分支型的PEG定点修饰提供了研究基础。

［1］Tischio JP，Patrick JE，Weintraub H S，et al.Short in vitro halflife of thymopoietin 32-36 pentapeptide in human plasma［J］.Int J Pharm，1979，14:479-484.

［2］Paolo C，Francesco M V.Pharmacokinetic and biodistribution properties of poly(ethylene glycol)-protein conjugates［J］.Adv Drug Deliver Rev，2003，55:1261-1277.

［3］Gerd G K.Site-specific polymer modification of therapeutic proteins［J］.Curr Opin Chem Biol，2005，9:555-560.

［4］DeGraw J I，Almquist G，Hiebert C K，et al.Stabilized analogs of tymopentin.1.4，5-Ketomethylene pseudopeptides［J］.J Med Chem，1997，40(15):2386-2397.

［5］De Graw JI，Almquist R G，Hiebert C K，et al.Stabilized analogs of thymopentin.2.1，2-and 4，5-Ketomethylene pseudopeptides［J］.JMed Chem，1997，40(2)15:2398-2406.

［6］李 倩，马亚平，王长林，等.采用固-液相相结合法合成聚乙二醇化胸腺五肽［J］.中国生化药物杂志，2010，31(5):289-292.

［7］付正明，王洪权.蛋白质多肽药物聚乙二醇定点修饰的研究进展［J］.军事医学科学院院刊，2007，31(2):178-182.

［8］Hamidi M，Azadi A，Rafiei P.Pharmacokinetic consequences of pegylation［J］.Drug Deliv，2006，13(6):399-409.

Synthesis of site-specific PEGylated thymopentin

SHI Min1，MA Ya-ping2，NI Jing-man1
(1 School of Pharmacy，Lanzhou University，Lanzhou 730000，China;2.Shenzhen Hanyu Pharmaceutical Co.，Ltd.，Shenzhen 518057，China)

Purpose To enhance the yield of site-specific PEGylated(10KD)thymopentin.Methods All the amino acids were step-wise assembled on Fmoc-Tyr(tBu)-wang resin by Fmoc/t-Butyl strategy.Then the Wang resins were cleaved and the side-chains were removed through treatment with trifluoracetic acid.Under alkalescent conditions，the mono-PEGylation was targeted to the ε-amine group of the lysine.The pegylated thymopentin was made by Pd/Ccatalytic hydrogenation.Results The total yield was 20%，which was improving for 10 times in comparison with the yield reported by us.Conclusion This method is easily handing with high yield and low cost for preparing pegylated TP5.

thymopentin;site-specific PEGylation;synthesis

TQ464.7

A

1005-1678(2012)05-0609-03

2011-12-27

史 敏，女，硕士研究生，研究方向为药物新制剂与新剂型研究，E-mail:minmichal@163.com;倪京满，女，通信作者，教授，博士生导师，从事药物新制剂与新剂型研究，E-mail:nijm@lzu.edu.cn。