高效液相色谱法测定乳制品中的叶黄素

高迎春，尹伶灵，陈玲，陆庆泉，牛华星，张呈军，魏秀丽

(山东省兽药质量检验所，济南250022)

高效液相色谱法测定乳制品中的叶黄素

高迎春，尹伶灵，陈玲，陆庆泉，牛华星，张呈军，魏秀丽

(山东省兽药质量检验所，济南250022)

建立了一种简单、快速、可靠的测定乳制品中叶黄素的新方法。乳制品中的叶黄素经正己烷提取，氮气吹至近干，残余物用正己烷－乙酸乙酯（70+30）溶解后，高效液相色谱法测定，标准曲线法定量。该方法具有良好的准确度和精密度，在不同乳制品中添加回收率范围为91.0%～102.6%，相对标准偏差（RSD）为0.64～2.92。该方法的检出限和最低定量限分别为20 μg/kg和50 μg/kg。

乳制品;叶黄素;高效液相色谱法

0 引 言

叶黄素(Lutein)是一种含氧的类胡萝卜素，在自然界中与玉米黄素共同存在，广泛存在于香蕉、猕猴桃、玉米和万寿菊中[1]。叶黄素具有很多重要的生理活性，如抗氧化、抗衰老、抗癌等。但是人体内不能自身合成叶黄素，只能从食物中摄取。通过补充叶黄素可以减少心血管病的发病率[2]，保护视力，预防近视、老年性白内障和老年黄斑变性的发生[3-4]。目前已有的乳制品中叶黄素的测定方法还比较少[5-6]，而且都存在一定的缺陷（适用范围窄，前处理复杂等）。因此，一种简单、快速、适应性好的可用于乳制品中叶黄素测定的方法亟待开发。本文建立了一种测定乳制品中叶黄素的新方法，乳制品中的叶黄素经正己烷提取后，高效液相色谱法测定，标准曲线法定量。

1 实 验

1.1 仪器

高效液相色谱仪（配紫外检测器）；MP200B天平，台式高速冷冻离心机，XW-80A涡旋混合器，HY-4调速多用振荡器。

1.2 试剂

叶黄素标准品（纯度为96.2%）；正己烷，乙酸乙酯，二氯甲烷均为色谱纯；海砂（分析纯）；实验用水均为超纯水。

1.3 标准溶液配制

标准储备液：精密称取10.0 mg叶黄素标准品，用二氯甲烷溶解并定容至10 mL容量瓶中，在 -80℃冰箱中避光保存，有效期一个月。

标准工作液：精密量取质量浓度为1 g/L叶黄素标准储备液1 mL用流动相（正己烷-乙酸乙酯（体积比，70+30））稀释定容至100 mL容量瓶中，现用现配。

1.4 方法

1.4.1 样品预处理

（1）液体试样。准确称取试样适量（精确到0.0001 g，试样中含叶黄素0.1 g以上），置50 mL具塞离心管中。在避光条件下，加入15 mL正己烷，充分混匀，振荡提取15 min，离心10 min，取上清液于另一离心管中。残渣再加正己烷10 mL，重复提取一遍，合并两次上清液于同一50 mL离心管中，50℃下氮气吹至近干。残余物用正己烷－乙酸乙酯（体积比，70+30）溶解并定容至1.00 mL，用孔径0.45 μm有机系滤膜过滤，供高效液相色谱分析。

（2）固体试样。准确称取试样适量（精确到0.0001 g，试样中含叶黄素0.1 g以上）于研钵中，加入适量海砂（试样质量的4～6倍）研磨成干粉状，转移至50 mL具塞离心管中。用10 mL正己烷分数次清洗研钵，清洗液转入离心管中。以下步骤按1.4.1（1）的 “振荡提取15 min，……”操作。

1.4.2 色谱条件

色谱柱：正相硅胶柱，250 mm×4.6 mm（i.d.），粒径5 μm，或相当者；流动相为正己烷-乙酸乙酯（体积比，70+30）；柱温为30 ℃；流速为1.0 mL/min；检测波长为445 nm；进样量为20 μL。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

通过查阅文献[7,8]和实验分析，我们最终选定了正相硅胶柱，紫外检测器。而文献报道中正相柱多采用环己烷-乙酸乙酯，丙酮等为流动相，经过多次试验，我们将流动相中的环己烷、丙酮换成实验室常用的正己烷，最终确定流动相为正己烷-乙酸乙酯。 然后，通过配制不同比例的正己烷-乙酸乙酯溶液作为流动相，分别将不同乳制品中添加叶黄素后进样。发现以正己烷-乙酸乙酯（70+30）为流动相时出峰时间较合适（13.652 min），不仅分离效果好，而且峰形也非常好（图1～图6）。

2.2 提取溶剂的选择

由于叶黄素易溶于二氯甲烷、正己烷、乙醚、丙酮等有机溶剂，故选择这4种溶剂提取试样中的叶黄素。实验结果表明，用二氯甲烷、乙醚提取时，叶黄素提取不完全，回收率较低；而丙酮回收率高但其毒性大、气味刺激；用正己烷提取时，叶黄素提取完全，回收率高，最终我们选择正己烷为提取溶剂。

2.3 标准曲线的绘制

准确量取叶黄素标准工作液，用正己烷-乙酸乙 酯 （70+ 30） 稀 释 成 质 量 浓 度 分 别 为0.05，0.10，0.20， 0.50，1.00，2.00 mg/L的叶黄素标准溶液，供高效液相色谱测定。以叶黄素标准溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。其线性回归方程为y=286530x+16921，相关系数为R=0.9995。通过数据可以看出，本方法具有良好的线性响应。

2.4 方法的准确度和精密度

在空白巴氏杀菌乳、酸乳、奶粉、奶酪、干酪、炼乳中添加不同浓度的叶黄素进行加标回收实验，平行测定6次，求相对标准偏差。结果如表1所示，在不同乳制品中，添加回收率范围为91.0%～102.6%，可以看出本方法的准确度符合乳制品中叶黄素的检测要求。6次平行测定的相对标准偏差（RSD）范围为0.64～2.92，证明表1本方法具有较好的精密度。

2.5 方法的检出限和定量限

通过加标回收率实验，分别以3倍信噪比和10倍信噪比计算方法的检出限和最低定量限。添加质量分数为20 μg/kg时，叶黄素峰信噪比（S/N）均＞3，确定为方法的检测限；添加质量分数为50μg/kg时，信噪比（S/N）均＞10，确定为方法的最低定量限。

表1 不同乳制品中叶黄素的回收率测定结果（n=6）

3 结 论

本文建立的测定乳制品中叶黄素含量的高效液相色谱法，其前处理简单、色谱条件易于实现，测试数据重复性好，回收率高，精密度和准确度均能满足食品理化分析的要求，适用于乳制品中叶黄素含量的日常检测。

[1]惠伯棣.类胡萝卜素化学及生物化学[M].北京：中国轻工出版社，2005.

[2]卢艳杰.黄体素、玉米黄质及其生理功能研究现状[J].食品与发酵工业，2003(2):80-84.

[3]OLMEDILLA B,GRANADO F,BLANCO I,et al.Journal of the Science of Food and Agriculture[J].2001,81(9):904-909.

[4]尤新.叶黄素及其护眼功能[J].中国食品添加剂，2003(5):1-3.

[5]奶粉中叶黄素的测定液相色谱一紫外检测法[S].中华人民共和国国家标准，GB/T 23209-2008.

[6]黄菲菲.乳与乳制品中叶黄素的测定—高效液相色谱法[J].中国乳品工业，2010（6）：54-59.

[7]张莉华.HPLC法测定食品中的叶黄素含量[J].中国食品添加剂，2006（5）：159-162.

[8]饲料中叶黄素的测定—高效液相色谱法[S].中华人民共和国国家标准，GB/T 23187-2008.

Determination of lutein in dairy products by high performance liquid chromatography

GAO Ying-chun,YIN Ling-ling,CHEN Ling,LU Qing-quan,NIU Hua-xing,ZHANG Chengjun,WEI Xiu-li
（Shandong Provincial Veterinary Medicine,Jinan 250022,China）

A simple fast and reliable method has been developed for the determination of lutein in dairy products.The samples were extracted by n-hexane,blown nearly dry with nitrogen.The residue was dissolved by n-hexane-ethyl acetate (70+30),and the final solution was determined by HPLC.The method was quantified by calibration curve method.The method has good accuracy and precision.The recovery of lutein in dairy products was 91.0%～102.6%.The relative standard deviations(RSD)was 0.64～2.92.The detection limits of lutein was 20 μg/kg,and the quantification limits was 50 μg/kg.

dairy products;lutein;high performance liquid chromatography

TS252.7

A

1001-2230（2012）04-0048-03

2011-12-07

高迎春（1957-），女，研究员，主要从事兽药和畜禽产品质量检验及研究工作。