反相离子对色谱法测定奶粉中核苷酸质量浓度

许彬，张仕华

（广东雅士利集团有限公司技术中心，广东 潮州515638）

反相离子对色谱法测定奶粉中核苷酸质量浓度

许彬，张仕华

（广东雅士利集团有限公司技术中心，广东 潮州515638）

为检测奶粉中胞嘧啶核苷酸、尿嘧啶核苷酸、腺嘌呤核苷酸、鸟嘌呤核苷酸、次黄嘌呤核苷酸5种核苷酸的质量浓度，建立起奶粉中5种核苷酸的反相离子对色谱法。样品经质量分数为10%乙酸去除蛋白，在流动相为1.4 mmol/L四丁基硫酸氢胺含0.01 mol/L磷酸二氢钾（pH=4.0）∶甲醇=96∶4的条件下用C18色谱柱分离，紫外检测波长254 nm，流速1 mL/min，标准曲线法定量。5种核苷酸的平均回收率和样品重复测定变异系数分别是95.7%，96.0%，90.8%，98.7%，99.3%和0.583%，0.147%，0.257%，0.387%，0.167%。该方法无需进行固相萃取，快速灵敏，简便准确，适用于奶粉中核苷酸质量浓度的检测。

反相离子对色谱法；奶粉；核苷酸

0 引 言

核苷酸是由含氮的碱基、核糖或脱氧核糖、磷酸3种分子连接而成[1]，是构成核酸的成分。目前婴幼儿奶粉中添加的核苷酸主要有5种：胞嘧啶核苷酸（CMP）、 尿嘧啶核苷酸 （UMP）、 腺嘌呤核苷酸（AMP）、 鸟嘌呤核苷酸 （GMP）、 次黄嘌呤核苷酸（IMP）。虽然核苷酸是婴幼儿的重要营养素，对其生长发育有重要作用，但有一定的含量范围，过低起不到应有的营养作用，过高则可能对婴幼儿正常生长发育产生不利影响。所以，建立起适合于婴幼儿奶粉中核苷酸含量的准确简便的检测方法极为重要。

目前，国内外文献中有许多应用高效液相色谱法进行核苷酸检测的报道[2-6]，这些方法都难以在企业中应用推广并将其作为常规检测。

本研究拟在查阅有关核苷酸检测资料的基础上，结合婴幼儿奶粉和当前企业普遍使用的色谱仪器与耗材的特点，建立起检测核苷酸质量浓度的准确快捷方法，为企业常规检测奶粉中核苷酸质量浓度提供技术手段。

1 实 验

1.1 主要仪器

Waters e2695高效液相色谱仪，Waters2489紫外检测器，超声波， C18（250 mm×4.6mm,5 μm）色谱柱。

1.2 试剂

核苷酸标准品：CMP，UMP，GMP，IMP，AMP（纯度≥99%），四丁基硫酸氢胺（纯度为99.4%），磷酸二氢钾，磷酸氢二钾，乙酸，盐酸，氢氧化钠，甲醇（色谱纯），试剂除指定说明，其余均为分析纯。

1.3 核苷酸标准溶液的配置

精确称取5种核苷酸标准品CMP，UMP，GMP，IMP，AMP各0.010 g，用水定容于100 mL棕色容量瓶中，作为标准储备液。再用水稀释成一系列标准工作液进行色谱分析，以峰面积对进样浓度进行线性回归。

2 方 法

2.1 色谱条件的建立

（1）色谱柱类型：使用C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱

（2）流动相组成：先配置浓度为0.1 mol/L的磷酸氢二钾，再配置含浓度为0.01 mol/L的磷酸二氢钾的1.4 mmol/L四丁基硫酸氢胺，并用浓度为0.1 mol/L磷酸氢二钾调其pH值以及加入一定体积的甲醇，根据标样和样品色谱图分离情况，确定流动相的pH值和甲醇体积比。

（3）其他色谱条件：紫外检测器，检测波长为254 nm，流速为1.0 mL/min，柱温30 ℃，进样量10 μL。

2.2 样品的前处理方法

准确称取5.00 g样品,用适量的50℃热水[1]旋涡混匀溶解，冷却至室温后将其放入超声清洗机（频率40 kHz）里超声10 min，然后溶液转入50 mL容量瓶中,采用3种样品处理方式沉淀蛋白：质量分数为10%乙酸[2]沉淀、质量浓度为10 g/L偏磷酸、调pH值；用超纯水定容至刻度，摇匀过滤，得到清亮的滤液，再使用0.45 μm滤膜过滤，得样品滤液并进行上机分析。对3种沉淀方式进行比较。

3 结果与分析

3.1 色谱条件的选择

色谱条件的选择主要涉及到检测波长、色谱柱和流动相。5种核苷酸在紫外区域有吸收，通过查阅相关文献，获知5种核苷酸在254 nm皆有紫外吸收。目前，C18色谱柱是最常见、用途最广的反相柱[7]，具有重现性佳，柱效高，易于推广等作用。核苷酸属于酸性离子型化合物，要在C18反相色谱住有保留，必须添加阴离子对试剂，使其与溶质离子结合形成疏水性离子对化合物，从而能够在两相之间进行分配，故选择四丁基硫酸氢胺。反相离子对色谱常用的流动相是以水为主体的缓冲溶液，其pH值对分离的影响最大。因为流动相的酸碱度决定了被分析物的解离状态，从而影响其与离子对的结合程度。因此，改变流动相的pH值是改善分离选择性的有效方法。通过试验摸索，发现含0.01 mol/L磷酸二氢钾的1.4 mmol/L四丁基硫酸氢胺[6]在pH=4.0的条件下能分开5种核苷酸。

以水为主体的流动相中通常添加有机溶剂，如甲醇、乙腈等作为改性剂，其作用是改善缔合分子在两相中的分配。在确定离子对试剂的浓度（1.40 mmol/L）和流动相的pH＝4.0后，又对含离子对试剂的缓冲盐溶液与甲醇的体积分数比为90∶10，92∶8，94∶6，96∶4，98∶2的流动相进行实验。结果表明：加入甲醇的体积对5个组分峰的保留时间影响较大，而且对5个组分峰影响的程度不一样，并直接影响出峰顺序及分离度。试验结果表明，含离子对试剂的缓冲盐溶液与甲醇的体积分数比为96∶4的流动相对5种核苷酸的分离度效果较好。因而，得到的最佳分析条件是使用C18色谱柱，离子对试剂四丁基硫酸氢铵浓度为1.4 mmol/L且含0.01 mol/L磷酸二氢钾，甲醇体积分数为4%，pH值为4.0，如图1所示。

3.2 样品前处理方式的选择

样品的前处理主要考虑的是既能将样品中的蛋白质分离出去，又能将核苷酸无损失的提取出来。为此我们将样品用水溶解，通过超声波振荡后采用3种样品处理方式来沉淀蛋白质：10%乙酸、15 g/L偏磷酸、调pH值。酸法沉淀蛋白的方法是将充分振荡溶解的样品转入50 mL容量瓶中，加入5 mL质量分数为10%的乙酸溶液或5 mL质量浓度为15 g/L偏磷酸，定容，充分混匀后用滤纸过滤；调pH值法沉淀蛋白质的方法是先用稀盐酸溶液将充分振荡溶解的样品溶液的pH值调至1.7，静止1 min后再用氢氧化钠调pH值至4.5后转入50 mL容量瓶，定容，混匀，用滤纸过滤。上述滤液通过0.45 μm的滤膜过滤后上机测定。通过对测定色谱图进行分析后发现：上述3种处理方式对色谱图中杂质峰的数量和色谱峰形及分离度都有一定的影响，调pH值和加入偏磷酸沉淀蛋白质的试液杂质峰要多于用乙酸沉淀蛋白质的方法。使用乙酸沉淀蛋白效果最好，色谱峰的峰形和分离度最好，而且方便。根据上述处理样品方法的比较，确定采用质量分数为10%乙酸沉淀蛋白质的样品处理方法，如图2所示。

3.3 方法的精密度、线性关系和准确度

按照既定条件连续5次测定同一样品，用峰面积相对标准偏差计算精密度，结果如表1所示。将核苷酸系列标准工作液按上述色谱条件进样10 μL，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，通过回归计算求得回归方程和相关系数，结果如表2所示。准确度用样品的回收率来评价，以5个样品为实验材料，加入核苷酸混合标准溶液，然后按上述操作步骤进行测定，测定结果如表3所示。

表1 精密度实验结果

表2 核苷酸标准曲线测定结果

表3 奶粉中核苷酸回收率实验结果

4 结 论

采用反相离子对高效液相色谱法对奶粉中核苷酸质量浓度进行测定，方法无需进行固相萃取和特殊设备，快速灵敏，操作简便，易于掌握，其测定精密度和准确度能满足乳制品分析的要求。因此，可作为常规检测方法应用。

[1]扬大进，方从容，马兰，等.婴幼儿配方奶粉中核苷酸含量的测定方法研究[J].中国食品卫生杂志，2003，15(6):497.

[2]张燕婉，鲁红军，王津生.高效液相色谱法测定食品中核苷酸的含量[J].食品科学，1994，6:59-62.

[3]任一平，黄百芬，连国义，等.应用HPLC反相色谱快速测定增鲜味精中的鸟苷酸和肌苷酸[J].食品与发酵工业，1994，6:36-41.

[4]黄晓兰，李科德，陈云华.15种核酸水解产物的高效液相分离及其在酵母抽提物分析中的应用[J].分析化学研究简报，2000，28(12):1504-1507.

[5]BRENDON D G，HARVEY E I.Development and Application of a Liquid Chromatographic Method for Analysis of Nucleotide and Nucleosides in Milk and Infant Formulas[J].International Dairy Journal，2007(17):596-605.

[6]张秋梅，郝岩平，宋戈.高效液相色谱法测定乳粉中的核苷酸[J].中国乳品工业，2009，4：51-54.

[7]刘国诠，余兆楼.色谱柱技术[M].北京：化学工业出版社，2004,199.

Determination of nucleotides in infant formula milk powder by reversed-phase ion pair chromatography

XU Bin,ZHANG Shi-hua
(Guangdong Yashili Group Co.,Ltd Technology Center，Chaozhou 515638,China)

For the determination of 5 nucleotides amount in infant formula milk powder,the Reversed-Phase Ion Pair Chromatography detector method was established.We established the method in which 10%acetic acid was used for elimination of protein,C18 column and the liquid phase of 1.4 mmol/L Tetarbutylammonium hydrogen sulfate(0.01 mol/L KH2PO4and pH=4.0)for isolation and the nucleotides were determined quantitatively by standard curve method at the UV 254nm and the flow of 1 mL/min.The average recovery rates of cytidine,uridine,adenosine,guanosine and inosine were 95.7% 、96.0% 、90.8% 、98.7% 、99.3%,respectively and the coefficient variance were 0.583% 、0.147%、0.257%、0.387%、0.167%.Without SPE,the method was able to quickly,accurate and sensitive detect nucleotides amount in infant formula milk powder.

Reversed-Phase Ion Pair Chromatography；milk powder；nucleotides

TS252.7

A

1001-2230（2012）04-0045-03

2011-12-20

许彬(1983-)，男，工程师，研究方向为食品安全和食品检测技术。