8q24和临床相关危险因素与中国北京汉族人群前列腺癌患病风险的关系

张玉荣 王建业 霍正浩 魏 东 杨一歌 杨 泽

随着人们生活水平的日益提高，前列腺癌(prostate cancer，Pca)的发病率日益增加。Pca作为威胁全世界男性泌尿生殖系统的恶性肿瘤，在美国成年男性中其发病率已经超越肺癌跃居首位［1］，在中国成年男性的泌尿生殖系统发病率中位居第3位［2］。Pca的高发病率使得人们对其日益重视。国内外众多学者对Pca进行了大量的研究，包括其发病机制、临床表现、诊断及治疗方法等的研究。对于病因方面的研究结果显示Pca的致病因素尚不十分清楚，可能与种族、遗传、食物、环境、性激素等有关。近期的研究结果则提示某些基因的突变在Pca的发病、进展及转移中起着重要的作用。本文借鉴国外对于Pca易感基因位点8q24(rs445114，C;rs620861，T;rs6983267，G;rs1447295，A;rs100001454，T;rs7837688，T)的研究结果，在中国北方人群中进行相应易感基因位点的研究，以探索其与中国北京汉族人群Pca临床相关危险因素之间的关联性。

1.材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 研究对象:Pca患者来自卫生部北京医院泌尿外科的门诊和住院患者，共124例，所有病例均经病理组织学确证。对照人群共138例，筛选自卫生部北京医院体检中心的常规体检人群，所有入选的对照均为男性，PSA＜4 ng/mL，并且无Pca家族史。所有研究对象均对该检测项目知情同意，并且提供了外周血用于检测。

1.1.2 主要试剂:全基因组DNA提取试剂盒购自 Bio Chain公司;Taq DNA聚合酶和dNTP购自北京鼎国生物技术有限公司;LC-green PLUS饱和荧光染料购自美国Idaho公司。引物由上海生工生物技术开发有限公司合成;基因测序由华大基因测序部完成。

1.1.3 主要仪器:PCR扩增仪为美国 MJ公司的PTC-225型PCR仪;高分辨熔解曲线(HRM)基因突变/基因分型检测系统为美国Idaho公司Lightscanner TMHR-I96;DNA定量分析仪为德国Eppendorf公司的Biophotometer蛋白/核酸比色仪。凝胶成像系统为美国Bio-Rad公司的Gel DOC-2000成像系统。离心机为美国Beckman公司的Allegra TM 21R型离心机。

1.2 实验方法

1.2.1 基因组DNA提取及定量:取EDTA抗凝的受试者外周血0.5ml，用全基因组DNA提取试剂盒抽提DNA，通过蛋白/核酸比色仪对提取的基因组DNA进行浓度和纯度的分析。根据测定结果将样本DNA稀释至20μg/μl的工作液置于4℃冰箱。

1.2.2 PCR 反应:以染色体 8q24 区(rs445114)为例。从Genebank中查取染色体8q24区附近的基因序列，引物设计通过Oligo 6.0和primer5.0软件完成。实验用引物详情见表1，寡核苷酸内参末端用 C3封闭，以阻止延伸反应。PCR反应体系 10μl，其中包含:DNA 模板 1μl，10X PCR，Buffer 1μl，10 mmol/L dNTP 0.2μl，Taq DNA 聚合酶(5U/μl)0.2μl，上下游引物(10pmol/μl)各0.1μl，1X LC-green PLUS 饱和荧光染料1μl，寡核苷酸内参0.2μl(高温寡核苷酸内参与低温寡核苷酸内参4个片段各0.05μl)，去离子水补充总体积至10 μl。PCR反应条件为:95℃预变性5分钟后进入主循环，95℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸 60秒，总共35个循环，完成后72℃延伸7分钟。之后进行HRM分析之前的变性和复性处理，程序为:95℃ 30秒，25℃2分钟，94℃30秒，24℃ 4分钟。

表1 PCR的引物序列、退火温度及其产物长度

表2 测序引物序列

1.2.3 HRM检测:将扩增好的PCR产物移入HRM专用96孔板内，在Lightscanner TMHR-I 96仪上进行HRM分析:升温到45℃时，以0.3℃/s的斜率采集熔解曲线，98℃结束，用LightScanner Call IT软件对采集后的曲线进行分析，判定基因型(如图1、图2)。

图1 8q24(rs445114)HRM分型的熔解曲线图

图2 8q24(rs445114)研究样本的抽样测序图

1.2.4 测序验证:根据HRM分析的不同熔解曲线确定不同的基因型。从所得的不同基因型的样本中分别随机抽取5例样本进行测序验证。需测序样本的DNA重新进行PCR扩增，测序所用引物为:rs445114，退火温度为50℃，上游序列为 5′-CAAGCAGTGATCCGTTT-3′，下 游 序 列 为 5′-GCAAGTAAGTGCTAAAATAAAGGTA-3′。

PCR 反应体系 50μl:DNA 模板 5μl，10X PCR Buffer 5μl，10mmol/L dNTP 1μl，Taq DNA 聚合酶(5U/μl)1μl，上下游引物(10pmol/μl)各 0.5μl，去离子水补充总体积至 50μl。PCR反应条件为:95℃预变性5分钟后进入主循环，95℃变性30秒，56℃退火45秒，72℃延伸60秒，35个循环之后72℃延伸7分钟。PCR产物将送至华大基因测序部进行测序验证。

1.3 统计学方法 采用SHEsis软件进行两组间的等位基因及基因型差异分析。应用MDR方法进行基因-基因交互作用分析及SPSS16.0进行基因环境交互作用分析。运用Hardy-Weinberg平衡检验研究样本的群体代表性，对照组与病例组间基因型与等位基因的分布用χ2检验;为评估风险等位基因和基因型与Pca的相关性，用比值比(OR)和95%的可信区间 (95%CI);以P＜0.05为差异显著性标准。

2.结果

2.1 基因型分析 以 8q24(rs445114)为例:8q24(rs445114)位点分为3种基因型:TT、CC、CT。通过HRM分型系统分析，可根据样本的熔解曲线差异，将所有样本分为3个组。三组之间的熔解曲线差异非常明显(图1)。在每组中随机挑选5例样本进行测序验证，进行基因型的确定以及HRM分型结果准确性的评估。HRM分型的结果与测序的结果完全吻合，准确率为100%，测序图见图2。测序结果进行网上BLAST比对，序列完全一致。

2.2 8q24(rs445114，C;rs620861，T;rs6983267，G;rs1447295，A;rs100001454，T;rs7837688，T)基因型与等位基因频率在Pca患者和正常对照中的分布 以Hardy-Weinberg平衡法检验正常对照组的基因型频率的分布具有群体代表性(P ＞ 0.05)。8q24(rs445114，C;rs620861，T;rs6983267，G;rs1447295，A;rs100001454，T;rs7837688，T)的三种基因型频率在Pca组和正常对照组间的分布无显著差异，两种等位基因频率在两组间的分布也无显著差异(P＞0.05)。(见表3)

表3 基因型与等位基因频率在Pca患者和正常对照中的分布

表3 续表

2.3 单倍型分析 见表4。

表4 8q24上rs445114，rs620861，rs6983267，rs1447295，rs100001454和rs7837688的单倍型分析

2.4 6个SNPs的基因型在Pca患者不同年龄、Gleason评分、PSA浓度及肿瘤分期等的分布(见表5) 携带8q24(rs445114，C)TC基因型以及8q24(rs620861，T)TC基因型的人群 Pca易感性与食用洋葱负相关(P1=0.007，OR=0.31，95%CI=0.12 ～0.79;P2=0.005，OR=0.30，95%CI=0.11 ～0.77)，携带8q24(rs6983267，G)TG基因型的人群Pca易感性与饮酒正相关 (P=0.007，OR=10.75，95%CI=1.35 ～86.14)，其他位点与Pca的发病年龄、Gleason评分、PSA浓度以及肿瘤分期等指标均无显著相关性(P＞0.05)。

表5 6个SNPs的基因型与Pca患者不同年龄、Gleason评分、PSA浓度及肿瘤分期等的关系

表5 续表

3.讨论

目前关于Pca发病机制的研究有几个方向，包括种族、遗传、食物、环境、性激素等。本文以易感基因作为主要方面，食物、环境等临床相关危险因素作为次要方面，对Pca进行多种病因分析。8q24区域是目前报道与Pca相关的较为确切的易感位点，最初在冰岛人群中发现8q24上有与Pca易感性相关的位点，而后其易感位点在欧美人群中进行了复制，多数报道其与Pca具有相关性。在日本人群的复制研究报告中显示有与8q24(rs6983267)关联的报道，也有与8q24(rs6983267)非关联的报道。因此我们有必要在中国北方人群中进行8q24多个易感位点的研究，观察这些易感位点是否在中国北方人群中具有研究意义，为国内Pca的病因学研究提供参考。

本文选取8q24上6个位点(rs445114，C;rs620861，T;rs6983267，G;rs1447295，A;rs100001454，T;rs7837688，T)进行研究，3种基因型和2种等位基因分析结果表明对照人群与患患者群之间差异无显著性(P＞0.05)。我们分析可能的原因是:遗传背景不同，生活环境有所差异，以及样本数目不够多。具体原因还有待于后来的科学工作者们加以实验证明。8号染色体的某些特定位点突变与多种疾病的发生密切相关。尤其是染色体8q24区的广泛基因关联研究(GWAS)报道显示其与多种癌症的发生具有密切联系，例如Pca、乳腺癌［3］、结肠癌、卵巢癌、膀胱癌、慢性淋巴细胞血液病［4～12］等。到目前为止，以及有报道超过14种SNPs在这一区域与各种不同癌症的发生具有关联，甚至有多篇文章还显示8q24的风险区域拥有某种调控能力。在芯片试验中，众多癌症(乳腺癌、膀胱癌等)的8q24风险区域上会富集增强子［13，14］，而且多个研究组芯片实验还报道了 Pca［15，16］和结肠癌［16，17］的8q24风险区域可以促使癌症基因的表达。可以看出8q24是多种癌症研究的热点区域，这对在此区域内进行Pca的研究具有一定的指导意义。

一个疾病的发生往往是由多种因素引发的。个体从胎儿期到以后的成长过程中，会有多种物理化学生物的因素影响到身体的发育。遗传是属于先天从父母那里继承来的不可改变的因素，然而很多具有易感基因的个体后天并没有发病，不具有易感基因的个体却发病，这就要归功于后天的环境因素。后天的某些生活习惯，接触的某些物理、化学物质等可能抑制或者诱导原癌基因的转变。基因与环境的交互作用分析已经逐渐成为科研工作者关注的热点。基因与环境的交互作用分析也使得我们更全面的了解疾病的发生，更好的对疾病发生给予解释。本文选取了部分日常生活中常接触的物质以及一些临床常规指标对Pca进行了基因与环境的交互作用分析。分析了6个SNPs的基因型与Pca患者不同文化程度、是否接触有毒物质、是否饮酒，是否食用洋葱，BPH有无及肿瘤分期等的关系，结果显示有多个阳性结果，说明基因加上外部影响因素可以综合影响Pca的发病，携带8q24(rs445114，C)TC基因型以及8q24(rs620861，T)TC基因型的人群Pca易感性与食用洋葱负相关(P1=0.007，OR=0.31，95%CI=0.12 ～0.79;P2=0.005，OR=0.30，95%CI=0.11 ～ 0.77)，携带8q24(rs6983267，G)TG基因型的人群Pca易感性与饮酒正相关(P=0.007，OR=10.75，95%CI=1.35 ～ 86.14)。众多的研究已经表明基因环境交互作用对于疾病的发生和进展具有重要作用，有的会起到协同作用，有的会起到拮抗作用。对这些影响发病的因素进行记录并统计分析，得出的结果可以帮助疾病的预防。本文报道的结果对Pca的病因作为参考，Pca的研究还有待继续研究。

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