8号染色体四个单核苷酸多态性与中国前列腺癌风险的关联性研究

张琳琳 王建业 徐 勇 杨 阔 杨一歌 王滨有 杨 泽

前列腺癌(prostate cancer，PCa)是男性最常见的与年龄相关的恶性肿瘤，主要发生在(75～79)岁老年人。在西方许多国家，PCa是男性最常见的恶性肿瘤。美国在对1975～2006年癌症发病率进行统计后，估算2010年PCa新发病例为217730例，占男性全身各部位肿瘤28%，位居第一，估计PCa的死亡人数为32505例，占所有肿瘤导致死亡的11%，仅次于肺癌，位居第二［1］。而我国PCa患病率过去一直较低，近年来随着人口老龄化增加，生活水平及医疗诊断技术的提高，PCa患病率缓慢增长，1993年为1.71人/10万，2000年为4.55人/10万。PCa已位居我国男性泌尿、生殖系统恶性肿瘤发病率的第3位，成为影响我国45岁以上男性生活质量和预期寿命的重要疾病之一［2］。

但是，PCa的发病机制尚不清楚，家族史和双生子研究表明，遗传因素是PCa发生的一个重要危险因素［3～5］。年龄、种族和家族史是已经确定的PCa主要危险因素。目前PCa特异性抗原(prostate specific antigen，PSA)在 PCa筛查中的应用引起众多争议［6］，因此，PCa的遗传学研究有助于为PCa发病机制的研究提供数据和寻找中国人群特异性的PCa标记物。2007年以来，学者们已经开展了多个国家和人群的PCa全基因组扫描和多群体的验证，不断阐明新的PCa相关基因［7，8］。但是，这些新的遗传风险标记在中国人群中得到研究验证的很少，有必要开展基于中国人的PCa相关基因研究，以便为临床转化应用和进一步深入研究提供参考依据。2012年7月，我们对北京市民中PCa患者和正常对照者 8q24区 rs6983561(C)、rs13252298(T)、rs12543663(T)和8q21 rs1512268(T)风险基因位点进行关联分析，并分析PCa患者中基因型和表型(临床、遗传、膳食习惯、嗜好等)的关系。

1.材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象:PCa患者来自卫生部北京医院泌尿外科，共124例，年龄(51～86)岁，平均年龄73.90岁;PSA值为0.15 ～1000.0 以上 ng/ml，平均 35.45ng/ml，均经组织病理学检查确诊。对照组138例，均筛自本院体检中心的常规体检人群，均为男性，无PCa和其他肿瘤家族史。PSA值为0～11.19ng/ml，平均 1.35ng/ml，并经直肠指诊和 B 超检查排除PCa，年龄(66～88)岁，平均年龄70岁，与PCa组比较差异无统计学意义(P＜0.05)。研究对象及程序经本院伦理委员会批准。

1.1.2 试剂:全基因组DNA提取试剂盒购自博尔诚(北京)科技有限公司;Taq DNA聚合酶和dNTP购自北京鼎国生物技术有限公司;引物由生工生物(上海)有限公司合成;基因测序由华大基因公司完成;饱和荧光染料购自美国Idaho公司。

1.1.3 主要仪器:DNA定量分析仪为NANODROP2000C;凝胶成像系统为美国Bio.Rad公司的Gel DOC-2000成像系统。离心机为美国Beckman公司的Allegra“21 R型离心机;PCR扩增仪为美国MJ公司的PTC.225型PCR仪;高分辨熔解曲线(high resolutionmelting，HRM)基因突变/基因分型检测系统为美国Idaho公司的Lightscanner TMHR-I 96。

1.2 实验方法

1.2.1 基因组DNA提取及定量:按试剂盒说明书进行操作，样本DNA放置4℃保存。

1.2.2 PCR反应:NCBI数据库下载SNP位点所在DNA序列。rs6983561(C)、rs13252298(T)、rs1512268(T)和rs12543663(T)附近的基因序列，引物设计通过oligo 6.0软件完成。rs6983561(C)上游引物5′-AGGAGAATTGCAAACT-3′，下游引物 5′-CCTTGATATGCAATTAGC-3′;rs13252298(T)上游引物 5′-CTTGCTGTCTTCTCAGATA-3′，下游引物5′-CACACTTGCCATTTAG-3′;rs1512268(T)上游引物5′-CCCAATGCAGATTGAGTTA-3′，下游引物 5′-GAAGCAAACCCTTTCTGTAGA-3′;rs12543663(T)上游引物 5′-GCCACCTCAATATGAATA-3′，下 游 引 物 5′-CCATCAGCTTTTTAGTTTC-3′。高温内参上游引物5′-GCGCGGCCGGCACTGACCCGAGACTCTGAGCGGCTGCTGGA-GGTGCGGAAGCGGAGGGGCGGG-3′，下游引物 5′CCCGCCCCTCCGCTTCCGCACCTCCAGCAGCCGCTCAGAGTCTCGGGTCAGTGCCGGCCGCGC-3′。寡核苷酸内参末端用C3封闭，以阻止延伸反应。PCR反应体系10μl，其中包含:DNA模板1μl，10 × PCR Buffer 1μl，10 mmol/L dNTP 0.2μl，Taq DNA 聚合酶(5U/μl)0.2μl，rs1465618 和 rs12621278 上 下 游 引 物(10pmol/μl)各 0.1μl，1X LC-green PLUS 饱和荧光染料1μl，寡核苷酸内参0.2μl(高温寡核苷酸内参与低温寡核苷酸内参4个片段各0.05μl)，去离子水补充总体积至10 μl。PCR反应条件为:95℃预变性5分钟后进入主循环，95℃变性30秒，50℃退火30秒，72℃延伸6秒，总共35个循环，完成后72℃延伸7分钟。之后进行HRM分析之前的变性和复性处理，程序为:95℃ 30秒，25℃ 2分钟，94℃ 30秒，24℃4分钟。

1.2.3 HRM检测:将扩增的PCR产物移入HRM专用96孔板内，在Lightscanner TMHR-I 96上进行HRM分析:升温至45℃时，以0.3℃/s的斜率采集熔解曲线，98℃结束，用LightScanner Call IT软件对采集后的曲线进行分析，判定基因型。

1.2.4 测序验证:根据HRM分析的不同熔解曲线确定不同的基因型。从所得的不同基因型的样本中分别随机抽取5例样本进行测序验证。需测序样本的DNA重新进行PCR扩增，测序引物，以rs6983561为例，上游引物5′-GAATTGCAAACTAATAGAACATATA-3′，下游引物 5′CATATCAAGGATATTTGGTATAATACA-3′，退火温度62℃。PCR反应体系 50μl:DNA 模板 5μl，10 × PCR Buffer 5μl，10 mmol/L dNTP 1μl，Taq DNA 聚合酶(5U/μl)1μl，上下游引物(10pmol/μl)各0.5μl，去离子水补充总体积至 50 μl。PCR 反应条件为:95℃预变性5分钟后进入主循环，95℃变性30秒，退火45秒，72℃延伸60秒，35个循环之后72℃延伸7分钟。PCR产物经8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，凝胶成像系统观察合格后，送华大基因公司进行测序验证。

1.3 统计学方法 采用SPSS17.0软件处理数据。运用Hardyweinberg平衡 (Hardy-Weinberg equilibrium，HWE)检验研究样本的群体代表性;用OR值及其95%CI评价相对风险;计量数据以表示，组间比较采用T检验;组间基因型频率及等位基因频率比较采用Fisher和Pearson χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2.结果

2.1 PCa候选基因关联分析 通过GWAS和查阅相关文献，本研究 确 定 rs6983561、rs13252298、rs1512268 和rs12543663为PCa患病风险的四个候选等位基因，并对四个 基因位点进行基因型和等位基因与PCa的关联分析，见表1。

表18 q24 区(rs6983561，C)、(rs13252298，T)、(rs12543663，T)和8q21(rs1512268，T)基因型和等位基因与PCa的关联分析

表 1 显示，rs6983561、rs13252298、rs1512268 和 rs12543663在各对照组中的变异基因型均符合HWE(χ2＜1)，无显著性偏 离。rs6983561，C、rs13252298，T、rs1512268，T 和rs12543663，T的风险等位基因频率(risk allele frequency，RAF)在两组间的分布差异无统计学意义(P＞0.05)。rs6983561、rs13252298、rs1512268 和 rs12543663 的风险基因及风险基因型均未检测到与PCa的关联。

2.2 PCa相关质量表型 根据PCa患者的质量性状(表型)，包括患者的临床特征、PSA、婚姻、膳食和教育程度等11类观察指标。为了检测PCa关联基因型的遗传模型，本研究采用了显性和隐性两种模型分析，见表2。

表2 112例PCa患者表型与4个基因型的关联分析

表2 续表

表2显示，在4个位点分类中，除了rs12543663的突变基因型与肿瘤分期有统计学意义(P=0.010)外，其他观察指标与这四个位点的各基因型无关。

2.3 PCa相关数量表型与基因型的关联分析 针对PCa患者的数量性状(表型)，共计12个观察指标，包括病程、PSA血清浓度等在3个基因型个体间分布的相应数据，按4个风险等位基因型分组进行显著性检验，见表3。

表3 PCa患者的临床特征、身体特征、时间连续变量、吸烟、饮酒和食物摄取量在4个基因型个体间的分布()

表3 PCa患者的临床特征、身体特征、时间连续变量、吸烟、饮酒和食物摄取量在4个基因型个体间的分布()

rs13252298 CC AA+AC P GG AG+GG P年龄(岁) 74.17 ±5.70 72.67 ±4.074 0.854 73.07 ±5.012 74.07 ±4.714 0.768*病程(年) 2.60 ±2.19 3.24 ±2.598 0.458 2.90 ±2.183 3.16 ±2.563 0.757 PSA(ng/ml) 2.86 ±0.378 2.55 ±0.608 0.086* 2.56 ±0.726 2.58 ±0.583 0.902起始烟龄(岁) 22.17 ±6.616 30.00 ±15.811 0.323 25.00 ±4.690 24.45 ±6.173 0.820吸烟年限(年) 12.50 ±6.124 13.11 ±8.953 0.829 26.2 ±14.498 28.87 ±16.002 0.725日吸烟量(支) 16.00 ±18.254 19.77 ±13.183 0.874 13.40 ±6.148 13.48 ±9.730 0.987戒烟年限(年) — 40.64±15.220 0.561 21.3±15.503 18.90±13.705 0.815起始饮酒年龄(岁) 30.00 33.56 ±12.681 0.029 43.33 ±7.572 33.64 ±20.427 0.228酒精度(%) 0 40.64 ±15.220 0.789 32.0 ±11.314 33.00 ±12.543 0.916饮酒年限(年) 40.00 30.96 ±13.681 0.536 27.00 31.73 ±13.44 0.738蛋类量(个) 1.00 ±0.00 1.20 ±0.447 0.533 1.20 ±0.447 1.19 ±0.441 0.959 BMI(kg/m2) 29.47 ±9.98 4.47 ±0.451 0.183*rs6983561指标23.941 ±3.99 25.042 ±5.303 0.417

表3 续表

表3显示，PCa患者的数量性状(表型)与12个观察指标关系中，携有rs1512268的GG风险基因型比携有AG或AA基因型的PCa患者饮酒的酒精度数高，并有显著性差异(P=0.01)。

2.4 连锁不平衡分析 对位于同一条染色体上且距离＜500kb的三个位点用Haploview V.4.0软件LD分析位点间的D′和 r2值，见表 4。从表 4可以看出，rs13252298与rs6983561两个等位基因的连锁作用与PCa有关(D′=0.676;r2=0.062)。合并病例和对照人群后对这三个点的连锁情况进行作图后推测，图1;同时对3个风险等位基因的单体型AA、AC和GA在病例和对照人群中的分布频率进行比较分析，见表5。表5显示，单体型AA、AC和GA在病例和对照人群中无统计学差异。

表4 8q24区上3个位点间的D′和r2值

图1 8q24上的4个点LD分析结果

表5 8q区上风险等位基因组成的单体型在病例对照人群中的关联分析

3.讨论

前列腺癌的发生原因很复杂，多项研究证明，其病因不仅与年龄、种族、家庭遗传有关，而且膳食结构、环境等非遗传因素与前列腺癌发生均有密切关系。其中，遗传和年龄因素是不变因素:绝大多数患者在45岁及以上发生，PCa患者的平均诊断年龄为70岁［6］。尸检研究［7］揭示，50岁男性中PCa患者占30%，70岁男性约80%患有PCa;而本研究对于另一个不变因素——遗传因素，即对PCa的部分相关基因位点进行联合分析，同时观察各自贡献PCa发生风险的独立作用。虽然每一基因均有多个SNP，但在遗传病因学研究中，通常有证据(文献报道和预实验等)基础上选择候选基因，作为疾病关联研究的策略之一，本组也采用了同样的研究策略。本研究对8q24区上的3个SNPs和8q21区上1个SNP做了与PCa发病风险的关联分析。

尽管近来许多研究结果表明，由于8q24区对 MYC(一种致癌基因)基因具有编码调控作用，所以8q24区与PCa发病具有密切关系［8］。但本研究结果却显示不同结果，候选的4个SNPs与北京市PCa患者均无关。

一项Meta分析表明，在同一类种族群体中，rs6983561与PCa十分显著相关性［8］;在 Murphy AB［9］的研究结果中也表明SNPs rs6983561在西部非洲人人群中与PCa具有十分显著相关性(P＜0.03)，但Murphy AB研究小组同时在加勒比海人群中进行同样的实验，却显示不同的结果，SNPs rs6983561与PCa没有相关性，该研究将这一原因归于种族的不同，所以本研究中出现这一结果的主要原因可能也与种族差异有关。在今后的研究中可以选择中国其地区人群进一步验证这一结果;Suzuki M［10］等在日本人群中对 rs6983561与PCa易感位点的研究结果表明，位于8q24区的 rs6983561与PCa的死因别生存(CSS)与总生存期(OS)有显著相关性。携有rs6983561CA/CC基因型的PCa患者生存期长与携有rs6983561 AA基因型的PCa患者。而本研究虽然对rs6983561的CSS与OS未做相关分析，但与病程做了相关研究探讨，结果没有相关性，本研究可以考虑进一步对CSS、OS与病程进行三方面的比较研究。另外，台湾人也有相关研究结果显示，携带rs6983561(C)的患者与PCa具有显著相关性，而且与PCa的恶化程度成正向相关性。另有一篇关于全基因组和复制研究的Meta分析［11］，其收集了21篇高质量文章，在71个群体间对31个候选SNPs与PCa相关性做了比较研究，结果中仍然显示rs6983561与PC具有显著相关性。

rs12543663和rs13252298均位于8p24区。在目前文献中没有发现对这两个基因位点与PCa相关性的报道。本实验室刘明的课题中对rs12543663和rs13252298做了基因型以及单体型分析，结果表明rs12543663和rs13252298与PCa均无相关性，但是发现rs12543663突变基因型与肿瘤分期有统计学意义(p=0.010)，即携有突变基因型 AA或 AC的rs12543663患者癌瘤直径多数大于＞5cm，而携有CC基因型患者的癌瘤直径多＜5cm，可能说明rs12543663患者的肿瘤增长较其他基因型患者肿瘤增长的速度快;而rs13252298与rs1016343、rs6983561和rs16901966的haplotype的分析结果显示，虽然独立的rs13252298与PCa无关，但rs13252298与其他同条染色体上的rs6983561基因位点连锁作用与PCa有相关性。

而rs1512268是位于前列腺抑制基因NKX3.1的8p21区的等位基因，Liu F，Hsing AW等［12］在中国人群中的研究结果表明，rs1512268与PCa的相关性达到了显著性水平(P=9.39 × 10-4);近期，Shusuke Akamatsu［13］在他的研究中明确提出，rs1512268导致PCa的易感性的原因是由于同条染色体上离其较近的rs11781886的连锁作用而引起的，rs11781886(C/T)是通过下调NKX3.1的表达，从而控制了NKX3.1这一抑癌基因的保护性作用而导致PCa的发生。而在本研究结果中却显示该等位基因与PCa发生无相关性，这可能与样本量的大小及人群差异有关。但本研究中却发现，rs1512268的GG基因携带者饮酒的酒精度显著高于AG和AA基因携带者(P=0.012)。

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9 Murphy AB，Ukoli F，Freeman V，et，al.8q24 risk alleles in West African and Caribbean men［J］.Epub，2012，72(12):1366-73.

10 Suzuki M，Liu M，et al.Association of rs6983561 polymorphism at 8q24 with prostate cancer mortality in a Japanese population［J］.Epub，2011，9(1):46-52.

11 Liu H，Wang B，Han C.Meta-analysis of genome-wide and replication association studies on prostate cancer［J］.pros，2011，1;71(2):209-224.

12 Liu F，Hsing AW，et al.Systematic confirmation study of reported prostate cancer risk-associated single nucleotide polymorphisms in Chinese men［J］.Epub，2011，102(10):1916-1920.

13 Akamatsu S，Takata R，et al.A functional variant in NKX3.1 associated with prostate cancer susceptibility down-regulates NKX3.1 expression［J］.Human molecular genetics，2010 Nov 1;19(21):4265-4272.