Pinch－3蛋白对细胞形态及牵引力的影响

周 历，马德顺，杨 毓，高淑云

（沈阳大学 生物与环境工程学院，辽宁 沈阳110044）

Pinch－3蛋白对细胞形态及牵引力的影响

周 历，马德顺，杨 毓，高淑云

（沈阳大学 生物与环境工程学院，辽宁 沈阳110044）

用基因敲除的方法比较了正常肾小球足细胞和Pinch－3蛋白缺失细胞的形态差异和牵引力的差异，发现当Pinch－3蛋白缺失后，细胞表面出现了许多孔隙，同时细胞投影面积平均增加40%；细胞的牵引力则平均减小40%左右，这说明当肾小球足细胞的Pinch－3基因的表达受到抑制以后，细胞膜上产生的孔隙使细胞膜变得松散，进而使得表面积增大.细胞牵引力减小40%，说明细胞膜上的孔隙对细胞牵引力的形成具有较强的影响.

Pinch－3；肾小球足细胞；基因敲除；细胞形态；影响

细胞形态和牵引力是细胞的重要物理性质，它与细胞的许多生物过程有着密切的关系，比如炎症反应、创伤修复、血管生成、形态保持、信号传导以及新陈代谢等［1］.细胞牵引力由肌动球蛋白的相互作用和肌动蛋白的聚合作用而产生［2－4］，受平滑肌肌动蛋白 （α－SMA）的调节［5－6］.不同的细胞其牵引力不同，相同的细胞在不同的发育阶段其牵引力也不一样［7－9］，例如前交叉韧带干细胞经过一周的分化，其牵引力将减小30%左右［9］.目前，关于细胞牵引力的研究还很有限，国内只有北京大学、北京理工大学和沈阳大学报道过该领域的研究成果［10］.Pinch－3蛋白对细胞的形态保持有着重要作用，它与整合素形成信号复合物，参与细胞的勃着勃附作用，从而调节细胞的形态［11］.为了观察Pinch－3蛋白对细胞形态和牵引力的影响，本研究用基因敲除的办法使Pinch－3基因沉默，用CTFM法测定了肾小球足细胞在基因敲除前后细胞牵引力的变化，观察和比较了细胞的形态变化，试图发现Pinch－3蛋白对肾小球足细胞的物理性质的影响.

1 材料与方法

1.1 人体组织及实验材料

人体组织肾小球足细胞由芝加哥大学附属医院提供，系28岁健康男性白人，死于车祸；转染培养基（sc－36868）、Pinch－3 sh RNA和cop GFP对照质粒购于美国百泰克公司，DMEM培养液，犊牛血清及所用实验材料购于西格玛公司.

1.2 细胞培养

将人体组织肾脏解剖并分离出肾小球足细胞置于培养皿中，充分剪碎、消化和吹打后，将组织悬液以1 000 r／min离心5 min去上清，加入培养液吹打，然后接种于100 m L培养瓶中，加入不含抗生素的DMEM培养液，内含20%犊牛血清，置CO2培养箱内，5%CO2，37℃培养.培养1 d换液，去除未贴壁的细胞.用倒置显微镜（尼康TE－2000）观察细胞生长状态.3 d后取出并用sh RNA转染培养基（sc－36868）漂洗一次，吸去培养基并迅速进行转染.

1.3 基因敲除

将Pinch－3 shRNA和cop GFP对照质粒加入转染培养基中，浓度为1 000 ng／μL，小心均匀地覆盖在漂洗过的细胞上，培养过夜，对照组只用cop GFP对照质粒处理，次日将转染后的细胞移植在测试细胞牵引力的弹性基质上，6 h后用荧光显微镜进行观察挑选转染阳性和阴性对照分别进行形态观察和牵引力测算.

1.4 细胞牵引力测算

采用 CTFM（Cell Traction Force Microscopy）技术，即显微镜追踪法测定细胞牵引力技术.这是一种根据细胞基质弹性表面形变来测算细胞牵引力的技术.在制备弹性基质时掺入荧光微珠，当细胞贴附后会使基质产生形变，当细胞脱离时再回复原位，这种基质的形态变化可以通过荧光微珠的位移表现出来，可以用荧光显微镜追踪观察.将细胞脱离前后的基质形态变化拍成图片，用MATLAB 7.0运行专用自编程序进行比较分析即可测算出细胞牵引力.其过程主要分为3个步骤：①拍摄细胞图片，以确定细胞牵引力的区域；②分别拍摄细胞贴附时和脱离后的基质形态图片，以确定荧光微珠的位移；③将拍摄的三张图片上机分析.

2 结 果

肾小球足细胞转染以后，形态上有了明显的变化，由于Pinch－3蛋白的缺失，在细胞膜表面形成了许多孔隙（图1），同时表面积明显增大（图2）；细胞牵引力则明显减小，平均减小40%左右（图3）；这与细胞表面积增大的结果是吻合的.

图1 基因敲除前后肾小球足细胞形态对比Fig.1 The comparison of cell morphology of podoeyte cells before and after knockout

图2 基因敲除前后肾小球足细胞表面积比较Fig.2 The comparison of projected area of podocyte cells before and after knockout

图3 基因敲除前后肾小球足细胞牵引力比较Fig.3 The comparison of cell traction force of podocyte cells before and after knockout

3 讨 论

Pinch－3蛋白对维持细胞形态具有重要作用，当Pinch－3基因的表达受到抑制，导致细胞膜的一些成分缺失，进而在膜上形成了许多孔隙；同时由于孔隙的增多，使膜的结构变得松散，导致细胞的表面积增大.

细胞牵引力减小的原因应该归结于细胞表面积的增大，因为细胞牵引力与细胞的投影面积成反比，表面积增大40%，在产生牵引力的其他因子不变的条件下牵引力减少40%，与细胞投影面积增加的结果是一致的.这说明Pinch－3蛋白除了影响细胞膜的组成外，还通过影响细胞表面积间接影响细胞的牵引力.

［1］ Chen J，Li H，Sundarraj N，et al.Alpha－smooth muscle actin expression enhances cell traction force［J］.Cell Motility and the Cytoskeleton，2007，64（4）：248－257.

［2］ Wang J H C，Lin J S.Cell traction force and measurement methods ［J］. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology，2007，6（6）：361－371.

［3］ Moustakas A，Souchelnytskyi S，Heldin C H.Smad regulation in TGF－βsignal transduction［J］.Journal of Cell Science，2001，114（24）：4359－4369.

［4］ Munevar S，Wang Y L，Dembo M.Traction force microscopy of migrating normal and H－ras transformed 3T3 fibroblasts［J］.Biophysical Journal，2001，80（4）：1744－1757.

［5］ Kong H J，Polte T R，Alsberg E，et al.FRET measurements of cell－traction forces and nano－scale clustering of adhesion ligands varied by substrate stiffness［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2005，102（12）：4300－4305.

［6］ Kawal－Kowase K，Sato H，Oyama Y，et al，Basic fibroblast growth factor antagonizes transforming growth factor－β1—Induced smooth muscle gene expression through extracellular signal－regulated kinase 1／2 signaling pathway activation［J］.Arteriosclerosis，Thrombosis and Vascular Biology，2004，24（8）：1384－1390.

［7］ Clement S，Hinz B，Duguna V，et al.The N－terminal Ac－EEED sequence plays a role inα－smooth－muscle actin incorporation into stress fibers［J］.Journal of Cell Science，2005，118（7）：1395－1404.

［8］ Bogatkevich G S，Tourkina E，Abrams C S，et al.Contractile activity and smooth muscleα－actin organization in thrombin－induced human lung myofibroblasts［J］.American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology，2003，285（2）：334－343.

［9］ 马德顺，高淑云，路春夏，等.前交叉韧带干细胞分化后其牵引力的变化［J］.中国细胞生物学学报，2010，32（1）：141－144.

［10］ 周治国，刘志文，范哲意.微悬臂梁阵列在细胞牵引力测量中的应用［J］.生物医学工程研究，2009，28（1）：75－78.

［11］ Velyvis A，Yang Y W，Wu C Y，et al.Solution structure of the focal adhesion adaptor PINCH LIM1domain and characterization of its interaction with the integrin linked kinase ankyrin repeat domain［J］.Journal of Biological Chemistry，2001，276（7）：4932－4939.

Effect of Pinch－3 Protein in Podocytes on Cell Morphology and Cell Traction Force

ZHOULi，MADeshun，YANGYu，GAOShuyun
（College of Biological and Environmental Engineering，Shenyang University，Shenyang 110044，China）

The change of morphology of podocytes was compared and the difference of cell traction force of podocytes was measured before and after knockout Pinch－3 DNA in this experiment.It was found that a number of pores appeared on the cells surface and the cells projected area increased by average of 40%after gene knockout，but the cell traction force of podocyte were significantly reduced by average of 40%.This suggests that when the expression of the podocytes Pinch－3 gene is inhibited，some pores will appear on the cells surface，and these pores make the membrane of the cells become laxer，and then the cells projected area become larger.The cell traction force decrease correspondingly by average of 40%，which suggests that the pores on the cell surface strongly affect the cell traction force.

Pinch－3；podocyte；knockout；cell morphology；effect

Q 28

A

1008－9225（2012）01－0045－03

2011－03－25

沈阳市引智计划资助项目（D20102101006）.

周 历（1986－），女，辽宁营口人，沈阳大学硕士研究生；马德顺（1962－），男（回族），辽宁沈阳人，沈阳大学教授，博士.

李 艳】