酶联免疫检测试剂盒检测水产品中孔雀石绿的应用研究

沈 丽张丽君谭 攀葛 虹谷雪平

（1深圳职业技术学院，深圳 518055） （2深圳市三方园生物科技有限公司，深圳 518055）（3深圳市水产品质量监督检测中心，深圳 518172）

酶联免疫检测试剂盒检测水产品中孔雀石绿的应用研究

沈 丽1*张丽君1谭 攀2葛 虹3谷雪平1

（1深圳职业技术学院，深圳 518055） （2深圳市三方园生物科技有限公司，深圳 518055）（3深圳市水产品质量监督检测中心，深圳 518172）

利用酶联免疫试剂盒检测水产品中孔雀石绿残留量，研究了国产试剂盒检测性能，并与高效液相色谱法进行了比较。结果表明：孔雀石绿含量在0.5 μg/kg～8 μg/kg范围时，试剂盒具有良好线性，最低检出限为0.16 μg/kg；试剂盒测得孔雀石绿总量的加标回收率在71%～120%，批内变异系数介于5.61%～18.6%；检测鳜鱼实际样品时，试剂盒和高效液相色谱法定性判定结果一致，定量结果有所差异，试剂盒测得鳜鱼样品中孔雀石绿残留量为37.75 μg/kg，高效液相色谱法测得结果为46.29 μg/kg，但准确度偏差范围尚符合国家质量监督检验检疫总局《残留分析质量控制》的要求。综上所述，国产酶联免疫检测试剂盒操作方便快速，灵敏度较高，重现性较好，适用于大量样品的快速检测。

水产品；孔雀石绿；酶联免疫；鳜鱼

孔雀石绿（MG） 是一种三苯甲烷类工业染料，曾因其价廉、高效而被广泛应用于水产养殖动物的真菌、细菌性疾病的防治，后随其在鱼体的高残留、对人体的高致癌性作用被逐步发现，孔雀石绿在许多国家被严禁使用：欧盟及美国FDA不允许其做为兽药用于水产业中，我国也将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》中。目前检测孔雀石绿的方法主要有液/质联用分析法（LC-MS）、高效液相色谱法（HPLC） 和免疫学方法等。LC-MS和HPLC法具有准确、重复性好、适用于定量检测等优点，是检测孔雀石绿的最终确认方法，但由于其成本高，操作繁琐，设备昂贵及操作人员需专业培训，实验周期长等原因，难以满足基层进行现场快速筛查的要求。国外已有高灵敏、商品化的孔雀石绿ELISA检测试剂盒出售，但总体价格昂贵，导致单次检测成本居高不下。近几年，国内也相继开发了相关的孔雀石绿酶联免疫快速试剂盒。本研究采用国产孔雀石绿酶联免疫检测试剂盒检测了水产品中残留孔雀石绿，并与HPLC法进行比较，旨在为适合于现场检测的酶联免疫试剂盒在大规模水产品检测中的实际应用，降低快速检测孔雀石绿的成本奠定基础，这对更好地开展水产品质量安全监管具有十分重要的现实意义。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

孔雀石绿标准品，Sigma公司；二氯甲烷，色谱纯；乙腈，色谱纯；乙酸，分析纯；无水硫酸钠，分析纯；正己烷，分析纯。孔雀石绿酶联免疫测定试剂盒由深圳市三方圆科技有限公司提供。

微孔板酶标仪（450 nm Thermo Multi skan spectrum）；Agitent1100高效液相色谱，美国Agitent公司；BUCHI R-200旋转蒸发仪；Evppendor5810R离心机；其他为国产常规仪器。

1.2 方法

以鳜鱼为检测对象，将鳜鱼去皮，沿脊背切下肌肉块，放入高速组织匀浆机20 000 r/min绞碎混匀。将鱼样分别进行酶联免疫检测和高效液相色谱测定。

1.2.1 酶联免疫试剂盒检测方法

样品前处理、ELISA测定程序均参照试剂盒中提供的产品说明书进行：2 g样品加提取液作用，离心得上清液，加氧化剂、正己烷萃取，离心取下层，吹干或蒸干溶剂，乙腈溶解沉淀，取适量溶解液进行酶联免疫检测，酶标仪测定OD值。以标准品为对照，每个样重复3次，所得吸光值的平均值再乘以100，得百分吸光度。

1.2.2 高效液相测定

样品前处理、色谱柱条件、操作步骤及计算依据国标GB/T20361-2006《水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定高效液相色谱荧光检测法》。

1.2.3 ELISA工作曲线建立方法

取 0 μg/kg、0.5 μg/kg、1 μg/kg、2 μg/kg、4 μg/kg、8 μg/kg标准品稀释液分别稀释 10 倍至终质量分数为 0 μg/kg、0.05 μg/kg、0.1 μg/kg、0.2 μg/kg、0.4 μg/kg、0.8 μg/kg，按照试剂盒说明书中酶联免疫测定程序，测得各浓度标准品的吸光值，所得吸光值的平均值再乘以100，计算得各浓度标准品的百分吸光度。以标准品质量分数的以10为底的对数值为横坐标，百分吸光值为纵坐标，绘制工作曲线。

1.2.4 ELISA加标回收率测定方法

称取2.0 g阴性样品各6份，加入50 mL聚四氟乙烯离心管中，依次加入不同体积的孔雀石绿标准品，使得鱼样中标准品质量分数分别为0 μg/kg、0.5 μg/kg、1 μg/kg、2 μg/kg、4 μg/kg、8 μg/kg，按照测定各样品百分吸光度。通过外标法工作曲线计算回收率。

2 结 果

2.1 工作曲线相关性比较

2.1.1 ELISA检测法工作曲线

下图1为ELISA检测法工作曲线。曲线方程为y=-76.002x-10.708，相关系数为 0.9 466。标准曲线中各标准品浓度对应的百分吸光值的标准误差（RSD） 为1.54%～16.4%。结果表明孔雀石绿在 0.5 μg/kg ～8 μg/kg 范围具有良好线性，最低检出限为 0.16 μg/kg。

2.1.2 高效液相-荧光法工作曲线

在高效液相色谱法测定中，配制质量分数在分别为 0.5μg/kg、1.0μg/kg、5.0μg/kg、10.0μg/kg、20.0 μg/kg、50.0 μg/kg、100.0 μg/kg、200.0 μg/kg的孔雀石绿标准溶液，以峰面积（y） 为纵坐标，以质量分数（x） 为横坐标，绘制标准曲线，见图2。曲线方程为y=307.116 02x-1.99e-1，相关系数为 0.999 87。孔雀石绿在 0.5 μg/kg ～ 200 μg/kg范围具有良好线性，检出限为0.5 μg/kg。

图1 ELISA测定孔雀石绿的标准曲线

图2 高效液相色谱-荧光检测法测定孔雀石绿的工作曲线

2.2 ELISA检测回收率、检出限和重现性

通过样品加标测定回收率试验，将样本的百分吸光值代入工作曲线，从工作曲线上读出样本所对应的值，作为10的幂，乘以稀释倍数，则为样品中所含孔雀石绿的量。测得孔雀石绿总量的加标回收率在71%～120%，批内变异系数介于5.61%～18.6%，重现性基本能满足要求，见表1。

表1 孔雀石绿及其代谢物加标回收率测定结果

2.3 鳜鱼样品测定结果

鳜鱼样品经前处理后，同时进行ELISA和高效液相荧光法检测，检测结果见表2。检测结果显示，高效液相荧光检测法和ELISA法对鳜鱼中阴性样品的判断一致，同为未检出；阳性样品的检测结果在数值上有一定的差距，但准确度偏差范围尚符合国家质量监督检验检疫总局《残留分析质量控制》的要求，因此可适用于大量样品的快速初检。

表2 鳜鱼样品中孔雀石绿测定结果

3 讨论

酶联免疫检测试剂盒是以免疫学方法为基础的快速检测方法，具有快速、灵敏、价格低廉、适合现场大规模检测等优点，是目前公认的最适合作为药物残留检测的方法之一。目前市面上所售孔雀石绿快速测定试剂盒种类很多，国内外的都有。大致原理基本相似。部分试剂盒分测显、隐性孔雀绿，但多数测总孔雀石绿。本研究中所用试剂盒采用竞争酶标免疫法，同时把隐性孔雀石绿氧化成孔雀石绿，测得总的孔雀石绿残留。

通过酶联免疫试剂盒法和HPLC法检测样品中孔雀石绿残留量比较发现，试剂盒法操作步骤简单，用时较短，易于高通量检测，但工作曲线和实际样品检测结果表明，试剂盒法的准确度与HPLC相比略低，试剂盒法工作曲线的相关系数为0.9 466，HPLC法相关系数为0.99 987；阳性样品两者所测得的结果有一定的差距，可见仪器检测法的准确度比试剂盒法高，主要原因是目前酶联免疫检测过程中以人工加样、洗板为主，相比仪器而言，操作过程的不稳定性较大，若能采用全自动加样洗板，应会增加此方法的准确度。本试剂盒的检测限虽然同国外检测试剂盒0.082 g/kg还不能相比，但与HPLC的检测限比较，已经能够满足GB/T19857-2005规定孔雀石绿的测定方法检测限的要求。测得孔雀石绿总量的加标回收率在71%～120%，批内变异系数介于5.61%～18.6%，因此试剂盒法的重现性能够满足要求。另外研究中通过10次空白测定，计算3倍标准差，得到最低检出限为0.16 g/kg，检测灵敏度为0.05 g/kg，基本能满足简单判断水产品中孔雀石绿残留阴、阳性样品的需求。检测实际样品时，试剂盒与HPLC法对阴性样品检出结果一致。

综上所述，本次应用的国产试剂盒能够满足目前国家标准规定检测孔雀石绿的基本要求，由于其操作简单、快速、低成本，适于目前水产品快速检测迫切需要。但是，同高效色谱-荧光检测方法一样，在样品前处理步骤如均质程度、计算方法上还需要进一步试验研究，优化条件。加标回收率结果也提示在均质程度、酶标板的处理、样品的保存、加样操作等环节都需要更多的探讨。与国标测定结果相比，还需要在操作程序等方面进行细致的研究改进，降低标准曲线相关系数的不确定度，以提高检测的精准度。

［1］ 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.国家标准和管理委员会.GB/T20361-2006水产品种孔雀石绿和结晶紫残留量的测定高效液相色谱荧光检测法［S］.北京：中国标准出版社，2006.

［2］ 杨金兰，陈培基，黎智广,等.高效液相色谱法测定水产品孔雀石绿残留量的优化研究［J］.南方水产，2010，6（4）：43-48.

［3］ 万译文，洪波，曾春芳，等.水产品中孔雀石绿残留的研究进展［J］.水产科技情报，2010，37（4）：191-197.

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［5］ 邢玮玮，王榕妹，王俊卿，等.酶联免疫吸附分析法测定水产品及水中孔雀石绿和无色孔雀石绿［J］.化学研究与应用，2010，22（1）：42-46.

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Application on enzyme-linked immunosorbent assay for determination of malachite green in aquatic products

SHENLi1*ZHANGLi-jun1TANPan2GE Hong3GUXue-ping1
1（Shenzhen polytechnic，Shenzhen 518055，China）2（Shenzhen triphil biotechnologyCo.，Ltd，Shenzhen 518055，China）3（Shenzhen aquatic products qualitysupervision and testingcenter，Shenzhen 518030，China）

Malachite green（MG）residues in aquatic products were determined by using ELISA kit.The performance of domestic reagent kit was studied and compared with high performance liquid chromatography method.The results showed that：this kit has good linearity while the content of the malachite green was in the range of 0.5 μg/kg～ 8 μg/kg，the minimum detectable limit was 0.16 μg/kg.The total recovery rate was 71% ～120%measured by malachite green kit，and the batch coefficient of variation was between 5.61% ～ 18.6%.On detecting of actual samples of mandarin fish，this kit has the same result with high-performance liquid chromatography method,while the quantitative has a varied result.The malachite green residue measured bysample kit was 37.75 μg/kg，while that measured by high performance liquid chromatography was 46.29 μg/kg.The accuracy deviation range was in line with the State Quality Supervision，Inspection and Quarantine Administration of the“quality control”requirements for residue analysis.To sum up，homemade enzyme-linked immunity detection reagent box is convenient，fast operation，high sensitivity，and good repeatability.It is suitable for the rapid detection of a large number of samples.

aquatic products；malachite green（MG）；enzyme-linked immunosorbent assay；mandarin fish

TS207.4

A

1673-6004（2012）02-0058-04

* 沈丽，女，1972年出生，1995年毕业于华南师范大学，硕士，讲师

2012-03-20