黑曲霉发酵液中脂肪酸化学成分的研究*

王 嫱冯焕鹏刘吴娟李 祝*陈 青

（1贵州大学生命科学学院，贵阳 550025） （2贵州大学化学与化工学院，贵阳 550025）

黑曲霉发酵液中脂肪酸化学成分的研究*

王 嫱1**冯焕鹏2刘吴娟1李 祝1***陈 青2

（1贵州大学生命科学学院，贵阳 550025） （2贵州大学化学与化工学院，贵阳 550025）

目的：分析黑曲霉（Aspergillus niger xj）发酵液中的脂肪酸成分。方法：液体发酵培养黑曲霉（Aspergillus niger xj），发酵液通过石油醚萃取，硅胶柱层析，石油醚-乙酸乙酯洗脱，得到的脂肪酸经甲酯化处理，通过气相色谱-质谱联用技术对其进行鉴定。结果：鉴定出4种脂肪酸成分。结论：黑曲霉（Aspergillus niger xj）发酵液中的脂肪酸成分主要为亚油酸、6-十八碳烯酸、14-甲基十五烷酸和硬脂酸。

黑曲霉；发酵液；挥发油；气相色谱-质谱法

黑曲霉属于真菌中的一个常见种，广泛分布于世界各地的粮食、植物性产品和土壤中，因其所产酶类丰富，所以在工业应用中是最常见的菌种之一。真菌中含有多种多不饱和脂肪酸，是花生四烯酸（ARA）、γ-亚麻酸（GLA）、亚油酸（LA）、二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六烯酸（DHA） 等脂肪酸的重要来源。多不饱和脂肪酸（PUFAs） 可以调节人体的脂质代谢，在抗过敏、抗炎症，降低心血管疾病的发病率，辅助改善记忆、辅助儿童智力发育，延缓衰老等方面具有重要的生理作用。但关于黑曲霉发酵液的化学成分方面尤其是发酵液中挥发油成分的研究工作较少，为进一步对黑曲霉的活性物质基础进行研究，我们选取贵州大学生命科学学院真菌资源研究所提供的黑曲霉（Aspergillus niger xj）的发酵液为研究对象，用石油醚对发酵液进行萃取，经硅胶柱层析，石油醚-乙酸乙酯洗脱，得到的脂肪酸经甲酯化处理后，通过气相色谱－质谱联用技术进行分析研究，从中鉴定出4种脂肪酸成分。

1 仪器与材料

1.1 菌株

黑曲霉（Aspergillus niger xj），贵州大学真菌资源研究所分离，保藏于中国典型培养物保藏中心，CCTCCNO：M206021。

1.2 培养基

PDA培养基：马铃薯200 g切块，用水煮沸30 min，纱布过滤，收集滤液加葡萄糖20 g，琼脂20g，水补足1000mL，pH自然。灭菌条件：121℃，30 min（以下灭菌条件与此相同）。

PDA液体培养基：配方同上，未加琼脂。

牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏：3.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，氯化钠5.0 g/L，琼脂15 g～20 g，水补足l 000 mL，pH 7.2～7.4。

1.3 主要试剂与设备

无水乙醇、乙酸乙酯、石油醚、甲醇等均为分析纯。

柱层析硅胶G；薄层层析用薄层板为GF254/CMC硬板，规格10 cm×3 cm。

HP6890/HP5973MS气质联用仪；R-201-B-II型旋转蒸发仪；SHZ-3型循环真空水泵；SW-CJ-IBV型无菌工作台。

2 方 法

2.1 菌株液体发酵

将黑曲霉（Aspergillus niger xj） 菌株接种于PDA固体斜面，27℃培养3 d～4 d，活化2～3代。挑取生长良好的活化菌株斜面，接入100 mL或500 mL三角瓶PDA液体培养基中，27℃、150 r/min，培养3 d作为种子液备用。按总体积10%（v/v）的比例将种子液转接到13 L或19 L发酵罐PDA液体培养基中，28±1℃，搅拌速度200 r/min～300 r/min，通气量控制在1 L/min～2 L/min，培养5 d终止发酵。4层无菌纱布过滤除去菌丝体，得其发酵液于4℃下保存备用。

2.2 供试样品的制备

发酵液用石油醚萃取，减压回收溶剂，得到供试样品石油醚项和水项。

2.3 石油醚项化学成分研究

2.3.1 样品的分离

取石油醚项进行硅胶柱层析，用V（石油醚）V（乙酸乙酯） =1∶0～8∶1进行梯度洗脱，得到油状物质，经薄层层析分析，为脂肪酸类成分。

2.3.2 样品的甲酯化

取54 mg油状物质于锥形瓶中，加入20 mL苯-石油醚（体积比1∶1） 溶解，再加0.2 mol/L氢氧化钾甲醇溶液10 mL，振荡均匀，在40℃水浴中恒温30 min，冷却，加入20 mL蒸馏水，摇匀，静置，待分层清晰后取上清液减压回收溶剂，得到甲酯化产物。

2.4.3 GC-MS分析条件

气相色谱条件：HP-5MS（0.25 mm×30 m，0.25 μm）；柱温 50 ℃（保留 2 min），升温至 280 ℃（5℃/min），保持3 min；汽化室温度为250℃；以高纯氦为载气；柱前压7.62 psi（0.53 kg/cm2），载气流量1.0 mL/min；进样量1 μL；分流比50∶1。

质谱条件：离子源为EI源；接口温度280℃；离子源温度230℃；倍增器电压1 785 V；四极杆温度150℃；电子能量70 eV；发射电流34.6 μA；质量范围10 amu～550 amu；溶剂延迟3 min。

3 结果与讨论

通过GC-MS对甲酯化后的样品进行分离，总离子流如图1所示。通过HPMSD化学工作站，结合Nist98标准质谱图库和WILEY质谱图库解析，并通过面积归一化法计算每个成分的含量，结果见表1。

图1 黑曲霉发酵液中脂肪酸总离子流图

表1 黑曲霉发酵液中脂肪酸化学成分及其相对百分含量

序号保留时间（min）化合物名称 分子量分子式 含量g/100g 3 26.670 6-octadecenoic acid，methyl ester（6-十八碳烯酸甲酯）296 C19H36O248.112 4 27.094 octadecenoic acid，methyl ester（硬脂酸甲酯）298 C19H38O23.215

从表1可看出，黑曲霉的发酵液中共鉴定出4种脂肪酸，其中十八碳烯酸含量最高，含量为48.112g/100g，其次是亚油酸，含量为41.919g/100 g，多不饱和脂肪酸占90.031 g/100 g。

与黑曲霉的菌丝体的挥发成分相比较，两种组分中都含有亚油酸和十八碳烯酸，特别是十八碳烯酸在菌丝体和发酵液中含量都较高；但在菌丝体中含量较高的三十二碳烷酸在发酵液中未检出，而发酵液中所含的甲基十五烷酸在菌丝体中则未检出。

黑曲霉发酵液石油醚项的主要成分亚油酸是人体必需脂肪酸，共轭亚油酸（Conjugated LinoleicAcid，CLA） 是亚油酸的异构体，对人类黑色素肿瘤，结肠直肠癌细胞及乳腺癌细胞培养物有毒杀作用，可以减少动脉壁上脂质斑的形成与沉积，防止动脉粥样硬症的发生。硬脂酸能部分降低胆固醇的溶解，硬脂酸能部分降低胆固醇的溶解,同时可能通过调节胆酸的生成，从而降低血清和肝脏中胆固醇含量。有关10-十八碳烯酸研究的报道较少，其有何特殊的功能及用途有待进一步研究。

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Analysis ofthe fatty acid from Aspergillus niger xjfermentation broth

WANGQiang1**FENGHuan-peng2LIUWu-juan1LI Zhu1***CHENQing2
1（College oflife science，Guizhou university，Guiyang550025，China）2（The chemistrydepartment ofscience college ofGuizhou university，Guiyang550025，China）

Objective：To study chemical constituents of fatty acid from A Aspergillus niger xj fermentation broth.Methods：After being cultured in PDA liquid medium，the fatty acid from Aspergillus niger xj was extracted by petroleum ether from the fermentation broth，separated by silica gel column chromatography method，eluted with petroleumether and ethyl acetate，then separated and analysed byGC-MS.Results：4 compounds were separated and identified.Conclusion The major fatty acids in Aspergillus niger xj fermentation broth including octadecadienoic acid，octadecenoicacid，pentadecanoicacidandoctadecanoicacid.

Aspergillus niger xj；fermentation broth；fattyacid；GC-MS

TS201.2+5

A

1673-6004（2012）02-0031-03

毕节地区马铃薯产业科技合作专项项目（201004）；贵州省农业攻关计划项目（20113053）；贵州省科学技术基金项目（20102065）

** 王嫱，女，1982年生，2007年毕业于四川大学微生物学专业，硕士，讲师

*** 李祝，通讯作者，Email：zhuliluck@163.com

2012-04-08

2012-05-13