小鼠Boule蛋白与Crem3′UTR结合并调节其表达*

林昌海，曾 梅，陈 述，卢亦路，马用信

(四川大学华西医院医学遗传研究室暨生物治疗国家重点实验室，成都 61004l)

哺乳动物的精子发生可以分为精原细胞(spermatogonium)分化为初级精母细胞(primary spermatocyte),初级精母细胞通过减数分裂形成次级精母细胞(secondary spermatocyte)，次级精母细胞通过有丝分裂形成圆形精细胞(round spermatid)以及圆形精细胞转变成成熟的精子(elongating spermatid)等4个主要阶段，其中减数分裂是精子发生过程的关键步骤。参与减数分裂调控的基因缺失或突变容易引起无精症和男性不育。DAZ(deleted in azoospermia)家族就是这些基因中的成员。DAZ基因家族属于生殖特异性基因，均在生殖细胞中特异表达，共同特点是都包含一个RNA结合域(RNA-binding domain，RBM)和DAZ序列重复(DAZ repeat)[1]。目前，已确认DAZ基因家族成员主要有3个，包括1个位于Y染色体上的DAZ基因和2个位于常染色体上的Dazl、Boule基因。在不同物种中，它们在生殖细胞发育的不同阶段起着关键的作用。Boule蛋白是2001年发现的DAZ家族新成员[2]，在睾丸组织中特异表达，是人精子发生过程中减数分裂转换的主要调控因子。Boule基因分布于所有后生动物，人类中定位于染色体2q33。Xu等[3]发现在小鼠和人类中，Boule起始表达于细线期的精母细胞，在偶线期加强，在粗线期达到最高，在双线期减弱，直至次级精母细胞和早期精细胞中都可以检测得到。Michael等[4]的实验结果表明，在敲除小鼠的Boule基因后，小鼠能够进行正常的减数分裂而产生圆形精细胞，但是圆形精细胞却不能正常地进行精子形态变化而形成精子。这说明Boule基因在精子形态变化这一过程中起着关键性的作用。Crem(cyclic AMP-responsive element modulator)基因是一种cAMP反应元素调节因子，在减数分裂后精子细胞中高表达，是一种转录激活因子[5]。Crem基因突变小鼠中[6]，精子形成过程的第一步即被阻断，生精上皮中后期的精子细胞、成熟精子均缺失，而发生凋亡的生精细胞数量显著增加，从而导致不育。由于Boule和Crem基因最终都能作用于精子成熟这一阶段，因此，在Boule和Crem之间可能存在某种关联。本文拟通过凝胶滞后实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)等方法，研究Boule蛋白与Crem基因之间的相互作用方式，揭示Boule蛋白在精子发生过程中所起的作用。

1 材料与方法

1.1材料 性成熟的小鼠睾丸组织购自华西动物中心7周龄昆明小白鼠；rTaq酶、高保真DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、逆转录酶购自大连宝生物工程公司；限制性内切酶购自Fermentas公司；表达载体pGEX-5X-3、大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)本研究室保存；RNA提取试剂盒购自Tiangen公司；Glutathione Sepharose 4 Fast Flow购自GE Healthcare Bio-Sciences AB公司；T载体试剂(pGEM-T-easy)购自美国Promega公司；SP6/T7探针标记试剂盒购自美国Promega公司；Hybond-N+膜购自Amersham Biosciences公司；地高辛检测试剂盒购自Roche公司。

1.2方法

1.2.1小鼠Boule基因的克隆 引物设计：根据GeneBank中Boule的mRNA的序列(NM_029267.3)，经过分析所克隆的核苷酸序列、表达载体多克隆位点内限制性内切酶的情况，设计并合成引物如下：正向引物：CGC GGA TCC ATG GAG ACC GAG TCC CGG (含有酶切位点BamHⅠ),反向引物：CCG CTC GAG GCC GCT CGA GTC AAA AT (含有酶切位点XholⅠ)。

PCR扩增：PCR反应体系为50 μL，94 ℃预变性4 min，94 ℃变性30 s，58.5 ℃复性30 s，72 ℃延伸90 s，35个循环，最后72 ℃延伸10 min。

1.2.2重组表达载体pGEX-Boule的构建 将纯化后的Boule的胶回收产物以及pGEX-5x-3质粒分别用BamHⅠ和XholⅠ进行双酶切，37 ℃过夜，然后用Omega Gel Extraction Kit回收。将回收的PCR产物和载体在16 ℃条件下连接过夜。连接产物转化DH5α感受态细胞。最后对重组菌落进行筛选、酶切、测序鉴定。

1.2.3基因工程菌的诱导、表达及纯化 pGEX-Boule和pGEX-5x-3表达载体分别转化BL21感受态细胞。挑取单克隆，37 ℃摇床振荡培养过夜。第2天以1∶100的比例接种至1 L含100 μg/mL Amp的LB液体培养基中，37 ℃摇床振荡培养至OD600达到0.6～0.8。加入IPTG至终浓度为0.2 mmol/L，20 ℃诱导培养4～6 h后将培养菌液置于冰上冷却，于12 000 r/min、4 ℃离心10 min，收集菌体。将收集的菌体用5倍体积的1×PBS悬浮，置冰上，超声破菌，裂解液于12 000 r/min、4 ℃离心15 min，收集上清。将蛋白质上清液加入到有GST Beads的离心管中，将离心管置于垂直混匀器上，在4 ℃结合60～90 min。在4 ℃离心机中500 r/min，离心3 min，弃上清液。每0.5 mL GST Beads中加5 mL PBS(1%TritonX-100)并来回颠倒混匀，4 ℃ 500 r/min，离心3 min，弃上清液。重复步骤4～5次。每0.5 mL GST Beads中加0.5 mL洗脱缓冲液，4 ℃结合20 min，4 ℃ 500 r/min，离心5 min，收集上清液。

1.2.4提取与Boule蛋白结合的mRNA 取新鲜睾丸组织，液氮充分研磨，然后加入裂解缓冲液，吸到1.5 mL离心管中，4 ℃，15 000 g离心10 min，收集上清液。将睾丸组织上清液、纯化后的蛋白、GST Beads、RNA结合缓冲液在4 ℃中结合1 h，然后用RNA结合缓冲液/0.25%TX(并含有肝素)洗10 min，随后再用RNA结合缓冲液/0.25%TX洗4次，用常规提取RNA的步骤将结合在GST Beads上的RNA提取出来。最后把从GST、GST-Boule蛋白中分离出来的RNA进行反转录。

1.2.5RT-PCR反应 设计Crem基因5′UTR、CDS和3′UTR特异性引物，利用逆转录得到的cDNA做模板，进行RT-PCR反应。

1.2.6凝胶滞后实验(EMSA) 根据RT-PCR反应，将PCR产物连接pGEM-T-Easy Vector载体，根据插入的方向以及插入的序列中是否含有该酶切位点，用相应的酶将载体进行线性化，分别在其扩增引物前加上T7启动子进行扩增，合成带有地高辛标记的探针。将探针分别和纯化后的GST和GST-Boule蛋白作凝胶迁移滞后实验。

2 结 果

2.1Boule基因的扩增和pGEX-Boule表达载体构建 PCR产物经1%琼脂糖电泳分析可见约900 bp的单一条带，片段大小与预期一致。重组质粒pGEX-Boule转化大肠杆菌DH5α后，经PCR及双酶切鉴定，酶切片段和载体大小与预期一致(图1)。

图1 Boule的PCR产物和pGEX-Boule载体双酶切琼脂糖电泳分析

2.2融合蛋白GST-Boule的表达及纯化 经双酶切初步鉴定正确的阳性克隆送测序，序列正确的表达载体和空载体pGEX-5x-3分别转化宿主菌(BL21)，IPTG诱导表达。诱导菌经过超声破碎离心后，收集上清液。用GST介质纯化后，进行SDS-PAGE电泳，在约66 KDa见一条带，与预期的GST-Boule大小相符融合蛋白(图2)。

1:诱导前GST-Boule；2:诱导后GST-Boule；3:诱导后GST-Boule破菌上清液；4:Marker；5:Marker；6:纯化后GST-Boule。

2.3通过RT-PCR证实Boule蛋白能与靶mRNA底物结合 用睾丸总RNA和GST结合的RNA为对照，进行RT-PCR的扩增。结果表明Crem5′UTR、Crem CDS和Crem3′UTR都能在总RNA反转录出来的cDNA中得到，GST-Boule蛋白能够扩增出Crem3′UTR，而GST蛋白都不能扩增出来(图3)，说明Boule蛋白能够与Crem mRNA 3′UTR结合。

Boule和GST各自扩增结果：睾丸总RNA(1，4，7)；GST(2，5，8)；GST-Boule(3，6，9)。

2.4EMSA实验证明Crem能与Boule蛋白结合 根据RT-PCR试验结果，在后续试验，选择Crem3′UTR进行的研究。利用EMSA验证Boule蛋白能否与Crem mRNA结合。首先用探针标记试剂盒制备Crem 3′UTR的探针。将不同浓度的GST-Boule蛋白与Crem 3′UTR mRNA探针进行结合，结果发现GST-Boule蛋白能与Crem 3′UTR mRNA探针结合，而GST蛋白不能与其结合(图4)。进一步说明Boule蛋白能够与Crem mRNA 3′UTR结合。

图4 通过EMSA实验证明Boule蛋白能与Crem3′UTR mRNA结合

3 讨 论

男性原发无精与少精症的遗传病因正日益受到重视，但由于生精过程的复杂性，长期以来对精子发生的病理生理认识不足，导致部分患者诊疗及预后判断上的困难。精子发生是一个复杂而且严密受控的过程，涉及细胞分裂、分化以及在生精小管微环境里各细胞之间的作用，涉及众多的基因在空间和时间上的差异分布和表达[2]。近年来，对与生精过程相关的基因研究仍未发现直接的证据证实某一特定基因与原发无精和少精相关，但目前已确定出部分候选基因，如Rbmy基因、DBY基因、DAZ(Deleted in azoospermia)基因家族等[7-8]。Boule是近年来发现的DAZ基因家族的新成员，在结构上与DAZ家族的其他成员(DAZ和DAZL)有很多共同点[9]，三者均含有一个非常相似的RNA结合域(RNA-binding domain，RBD)或RNA识别基序(RRM)，而这个RNA结合域与其他RNA结合蛋白不同[10]，三者均含有DAZ重复序列，而这个重复序列可能与蛋白质交互作用有关[11-12]。研究发现，DAZ基因仅在灵长类表达，DAZL基因分布于脊椎动物中，而Boule基因在所有后生动物中都有表达，因此，可以推断与DAZ和DAZL相比，Boule是最原始的精子发生调控基因。

Xu等[13]在敲除了果蝇的Boule基因后，其生殖细胞停留在第一次减数分裂中期而不能进入第二次减数分裂从而失去生殖能力，而在转入人的Boule基因后，果蝇恢复了正常的减数分裂而能够正常的繁殖。经分析，人类和果蝇的Boule蛋白在氨基酸水平上有42%相似性(30%相同)，其中RBM结构域上有80%的相似性。这一研究结果表明Boule在进化上高度保守而且在精子发生过程中Boule起着一个至关重要的作用。Maines等[9]研究发现，在果蝇中Boule蛋白表达始于第一次减数分裂前期，调控Twine的表达，而Twine可磷酸化cdc25进而激活成熟促进因子(MPF)，MPF作为减数分裂过程中的关键性控制因子使细胞从G2期进入M期完成第一次减数分裂。Xu等[3]发现在小鼠和人类中，Boule表达贯穿于减数分裂和精细胞。Michael等[4]的实验结果表明，在敲除小鼠的Boule基因后，小鼠能够进行正常的减数分裂而产生圆形精细胞，但圆形精细胞却不能正常地进行精子形态变化而形成精子。这说明Boule基因在小鼠精子形态变化这一过程中起着重要的作用。

由于Boule基因是一种RNA结合蛋白，为了更好地了解Boule对生殖细胞影响的分子机制，本研究从分离它结合的靶mRNA着手，研究它对生殖细胞的作用。Crem基因在减数分裂后精子细胞中高表达，作为一种转录激活因子，它对一些单倍体生殖细胞转变为精子的基因的激活有重要作用，能抑制精细胞凋亡[14]。本研究结果表明Boule蛋白能够结合Crem基因mRNA的3′端非翻译区，提示Boule蛋白通过结合Crem mRNA 3′UTR的方式来调控Crem蛋白的表达。在Boule基因缺失的小鼠中，Crem基因的mRNA不能正常地翻译表达，因而精细胞转变为精子的过程不能被激活，导致无成熟精子的形成。

由于Boule基因序列在果蝇、斑马鱼、小鼠、灵长类和人类中高度保守[15]，因此，它们可能拥有相同的靶mRNA，通过研究Boule在这些物种中的靶mRNA，分析这些靶mRNA在进化过程中是否高度保守，以及Boule蛋白是通过哪些方式参与这些靶mRNA的代谢过程，有助于全面深入地了解Boule基因在调控精子发生过程中的作用。

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