漆酶和APMP废液中酚类物质共同改善OCC纸浆纤维性能的研究

张鑫璐 裴继诚 张方东 于秀玲 胡惠仁

（天津科技大学天津市制浆造纸重点实验室，天津，300457）

近年来用漆酶、漆酶/介体体系处理纸浆纤维使其改性从而提高成纸强度的研究引起了广泛关注［1］。同时，已有文献介绍用木素小分子酚类衍生物作为漆酶/介体体系中酶催化的天然介体，以改变纸浆物理强度、光学性质等［2］。如果能在造纸原料和浆料体系中寻找生态和环境友好型并且易获得的天然介体将有利于进一步推进漆酶/天然介体体系的工业化应用。Wagberg L.等人［3］对热磨机械浆的废液进行了分析，表明溶解和胶体物质（dissolved and colloidal substances，DCS）中60％为碳水化合物、30％为木素碎片酚类物质；这说明废液中含有大量的木素酚类物质，同时，酚类化合物又是造纸废液中DCS的组成成分，而DCS的积累对纸机运行和生产均有很多不利影响［4-5］。

本实验用漆酶和APMP废液共同处理浆料体系，在漆酶作用下，废液中的酚类物质从废液中沉淀出来，并与纤维表面的木素形成自由基缩合，以达到去除废液中酚类物质、降低废水污染负荷和赋予纤维良好表面性能的目的。同时，采用气相色谱-质谱联用（GC-MS）对APMP废液中的天然酚类物质进行鉴别，对检测出的酚类物质进行模型物凝胶色谱（GPC）测定，并分析不同方式处理的OCC纸浆的纤维表面性能和成纸物理性能。

1 实验

1.1 原料

OCC纸浆：取自天津广聚源纸业，主要为国产OCC纸浆；APMP：取自濮阳龙丰纸业；漆酶：诺维信公司（Novozymes A/S）生产，商品名Novozym51003，酶活为800U/mL；紫丁香醇、松柏醇和1-甲基咪唑：Sigma-Aldrich化学品公司生产；乙酸酐：天津市化学试剂二厂生产。

1.2 实验仪器

高浓水力碎浆机：美国Adirondack Machine Corporation制造；PFI磨：瑞典L＆W公司制造；快速纸页成形器：德国ESTANIT GmbH制造，900428型；环压强度测试仪：瑞典L＆W公司制造；纸张抗张强度测定仪：瑞典L＆W公司制造；气相色谱-质谱仪：美国瓦里安技术有限公司；凝胶渗透色谱仪：美国Waters公司，Waters410示差检测器，515型；Fiber-Tester纤维形态分析仪：瑞典L＆W公司制造，902型；扫描电子显微镜：Philips FEI QUANTA 200，SEM X-300。

1.3 实验方法

1.3.1 APMP废液的制备

将APMP放入塑料袋平衡24h后测定水分。每次称取30g绝干浆料经水浸泡后补加水至浆浓10％，使用PFI磨对浆料进行打浆，控制最终打浆度为40°SR，将打浆后的纸浆放入3000mL烧杯中，加入一定量蒸馏水调节浆浓至3％，放入45℃恒温水浴中恒温，搅拌2h后布袋脱水得APMP废液。

1.3.2 OCC纸浆的制备

（1）碎浆

将试样撕成规格为30mm×30mm的碎片，放入塑料袋平衡24h后测定水分。称取一定量OCC纸浆碎片经水浸泡12h后在高浓水力碎浆机中进行碎浆。碎解后的OCC纸浆用筛缝为0.25mm的平板筛浆机筛浆，良浆备用。

（2）打浆

根据QB/T 1463—1992方法，使用PFI磨进行磨浆，浆浓为10％，控制最终打浆度为45°SR。

1.3.3 GC-MS测定

（1）衍生化处理

取一定量废液试样，加入1-甲基咪唑和乙酸酐进行乙酰化，然后用二氯甲烷萃取［6］。

（2）GC-MS分析条件

气相条件：DB-1毛细管色谱柱（0.10μm×0.25mm×30m）；测试过程：起始温度60℃，保持1min。程序升温，每分钟10℃，升至320℃，保持3min。进样口温度为320℃，采用高纯氦气作为载体，流量为1mL/min，分流比5。质谱条件：传输线温度280℃，离子阱温度220℃。扫描方式：全扫描，扫描范围：50～1000u。电离方式：EI（电子轰击）。

1.3.4 凝胶渗透色谱测定

（1）样品处理

松柏醇、紫丁香醇漆酶处理样，用0.45μm的微滤膜过滤，洗涤。所得沉淀产物风干。风干样置于P2O5真空干燥器中，待质量恒定时进行测定。

（2）测试条件

色谱柱：Ultrastyragel 103A；柱温：40℃；流动相：四氢呋喃；流速：1.0mL/min；以聚苯乙烯为标样。

1.3.5 纤维形态分析

称取0.1g绝干纤维（精确至0.1mg），用分散器打散后，用水稀释，在Fiber-Tester纤维分析仪上测定纤维的长度、宽度、粗度、形态因子及扭结指数。

1.3.6 扫描电镜观察

将手抄片喷金后，在扫描电镜上观察并照相，加速电压为20kV。

1.3.7 漆酶处理OCC纸浆

取30g绝干OCC纸浆，调节浆料pH值到6.0后加入APMP废液，置于恒温水浴中，通入空气5min后加入漆酶，继续通空气直至反应结束。

1.3.8 纸张性能测定

根据GB/T465.2—1989方法测定手抄片的湿抗张强度（试样浸泡时间为1h，然后用滤纸均匀压干、测试）。

将手抄片试样在相对湿度近100％、温度25℃的环境中放置48h［7］，然后根据GB/T2679.8—1995方法测定手抄片的环压强度。

2 结果与讨论

2.1 APMP废液中酚类物质分析

GC-MS技术可以提供保留时间和质核比信息，在制浆造纸工业中，常将其用于造纸植物纤维原料和纸浆中糖类各组分的分离与鉴定，以及分析木素降解产物［8］。APMP废液乙酰化后经二氯甲烷萃取产物的质谱图和标准质谱库对照图如图1～图3所示。

图3 乙酰化松柏醇的质谱图A与4-［3-乙酰氧基-1-烯丙基］-2-甲氧基-苯酚乙酯标准谱图B

从图1可看出，保留时间4.379min出峰物质的质谱图（见图1A）与标准谱图库（见图1B）的4-甲氧基-苯酚乙酯相似度较高；图1A中乙酰化物质特征离子峰m/z为124.0，标准谱图库中4-甲氧基-苯酚乙酯的特征离子峰m/z也是124.0；依质谱图信息可推知保留时间4.379min的出峰物质为对-甲氧基-苯酚，其是废液中对羟苯基型木素小分子类物质的代表。

从图2可看出，保留时间9.256min出峰物质的质谱图（见图2A）与标准谱图库（见图2B）的2，6-二甲氧基-苯酚乙酯相似度较高；图2A中乙酰化物质特征离子峰m/z是154.0，标准谱图库中2，6-二甲氧基-苯酚乙酯的特征离子峰m/z也是154.0；依质谱图和相似度可推知保留时间9.256min的出峰物质为2，6-二甲氧基苯酚即紫丁香醇，其是废液中紫丁香基型木素小分子类物质的代表。

从图3可看出，保留时间12.573min出峰物质的质谱图（见图3A）与标准谱图库（见图3B）的4-［3-乙酰氧基-1-烯丙基］-2-甲氧基-苯酚乙酯的相似度较高；图3A中乙酰化物质特征离子峰m/z是137.0，标准谱图库中4-［3-乙酰氧基-1-烯丙基］-2-甲氧基-苯酚乙酯的特征离子峰m/z也是137.0；依质谱图和相似度可推知保留时间12.573min的出峰物质为4-［3-乙酰氧基-1-烯丙基］-2-甲氧基-苯酚即松柏醇，其是废液中愈创木基型木素小分子类物质的代表。

GC-MS的测试表明，APMP废液乙酰化后经二氯甲烷萃取产物中含有对-甲氧基-苯酚、紫丁香醇和松柏醇这3种酚类物质。

2.2 漆酶处理前后废液中酚类物质的变化

APMP废液和漆酶处理的APMP废液经乙酰化后再经二氯甲烷萃取产物GC-MS色谱总离子流图如图4和图5所示。

从图4可以看出，APMP废液乙酰化后的样品中4-甲氧基-苯酚乙酯、2，6-二甲氧基苯酚乙酯和4-［3-乙酰氧基-1-烯丙基］-2-甲氧基-苯酚乙酯分别在4.379min（a）、9.256min（b）和12.573min（c）出峰很明显。从图5发现对应的漆酶处理样相应时间对-甲氧基-苯酚和松柏醇峰消失，即检测不到对-甲氧基-苯酚和松柏醇单体的存在，并且总离子流程图中紫丁香醇的色谱峰强度减弱，因此，推测漆酶对APMP废液中酚类物质有一定的去除作用。

为了进一步计算漆酶对废液中酚类物质的去除率，利用内标法对其进行了计算，内标物选取苯乙醇，对苯乙醇和酚类物质的色谱峰积分求峰面积，计算在不同样中酚类物质相对于苯乙醇色谱峰的比值，进而计算出漆酶对酚类物质的去除率。漆酶处理APMP废液后，对-甲氧基-苯酚和松柏醇的去除率达到100％、紫丁香醇的去除率接近50％。

2.3 凝胶渗透色谱分析

通过GC-MS分析可以确认，在APMP废液中含有对-甲氧基-苯酚、紫丁香醇和松柏醇，并且推测出在漆酶处理过程中参与了反应。Carsten Mai等人［9］研究表明，漆酶可以催化木素结构中酚羟基生成苯氧自由基，苯氧自由基之间可以发生共价连接，从而使木素之间发生共聚。为了进一步确定漆酶处理后酚类物质的变化情况，选取模型物紫丁香醇和松柏醇（分别代表APMP废液中出峰较明显的紫丁香醇和松柏醇）进行机理研究，探讨漆酶处理后产物分子质量和分散性的变化（见表1）。

紫丁香醇纯品的相对分子质量为154.16，由表1可知，漆酶处理后数均相对分子质量上升至698，说明反应为聚合反应，该产物大约是由5个紫丁香醇分子发生聚合作用生成。由此可见，产物的数均和质均相对分子质量比较接近（Mn为698、Mw为745）；分散性为1.066，依分散性可看出，产物接近单分散样品，分子质量分布较集中。

表1 紫丁香醇和松柏醇模型物漆酶处理样的相对分子质量及分散性

松柏醇纯品的相对分子质量为180.20，由表1结果可见漆酶处理后数均相对分子质量上升至1658，说明该反应为聚合反应，产物大约由10个紫丁香醇分子发生聚合作用生成。产物分散性为1.138，说明这种物质的分散程度较低。

因此，漆酶处理APMP废液后，酚类物质在废液中消失或含量明显降低是因为废液中酚类物质在漆酶处理过程中发生了自由基缩合反应，导致聚合后的酚类物质从废液中沉淀出来（实验中发现有沉淀现象）。

2.4 采用不同方式处理OCC纸浆

（1）对纤维形态的影响

曾使用紫丁香醇和漆酶共同改善OCC纸浆的成纸性能；与单独漆酶处理相比，应用漆酶/紫丁香醇体系处理后，纤维粗度有所增加。前述的GC-MS分析可以证实，APMP废液中也含有紫丁香醇。为了研究漆酶和天然酚类物质（来自废液）共同处理对纤维的改性效果，对不同处理方式的纸浆进行了纤维形态分析（见表2）。

由表2可知，两种方式处理OCC纸浆仅对纤维粗度有较大影响。纤维粗度增加可能是浆中木素及废液中天然酚类物质在漆酶作用下产生自由基缩合的结果。这与凝胶色谱分析的结果一致。

（2）扫描电镜分析

从图6可见，未经漆酶处理的空白样的纤维表面光滑、平整，纤维间连结不紧密，呈疏松多孔状（见图6a）；单独使用漆酶处理OCC纸浆（见图6b），由于处理过程中木素会发生降解去除，部分纤维表面变得粗糙不平；用漆酶和废液共同处理OCC纸浆（见图6c），纤维表面更粗糙，纤维与纤维相互“黏结”形成一体，出现大面积的纤维“融结”现象。这说明漆酶和天然酚类物质（来自废液）共同处理使纤维表面发生明显改性，废液中小分子酚类物质的加入促进了漆酶处理对纤维的活化作用，更有利于纤维间发生交联作用。在漆酶和废液共同处理OCC纸浆过程中，天然酚类物质被催化氧化成自由基，其可以再氧化浆中木素，特别是占大比例的非酚型结构木素形成自由基缩合［10］。这种自由基缩合不仅发生在木素之间，还能发生在木素和酚类物质之间，因此，纤维表面的这些膜状物质和沉淀物（见图6c）就是漆酶处理过程中废液中的酚类物质形成自由基缩合后最终迁移到纤维表面与表面木素形成化学键连接的结果，同时使纤维表面木素含量提高。

表2 纤维形态测定结果

图6 OCC纸浆扫描电镜图

（3）对成纸强度的影响

不同处理方式对OCC纸浆成纸强度的影响如表3所示。与空白样相比，单独使用漆酶处理以及漆酶和天然酚类物质（来自废液）共同处理均可催化浆中木素氧化形成酚氧自由基，并在纤维间形成自由基缩合，最终达到提高成纸强度的目的。

由表3可见，与空白样相比，漆酶处理、漆酶和天然酚类物质（来自废液）共同处理OCC纸浆后成纸强度明显提高，如干抗张指数和干环压指数分别提高9.98％和10.47％；对于湿强度，单独漆酶处理OCC纸浆，其湿抗张指数提高11.66％，使用漆酶和APMP废液共同处理OCC纸浆后，其湿抗张指数提高了27.60％。加入APMP废液后，废液中大量小分子酚类物质参与了漆酶催化提高纸浆强度的反应，其湿环压指数提高了30.80％。这主要是天然酚类物质形成的自由基可以继续氧化木素中非酚型结构［10］，导致纤维间形成更多的化学键。纤维间化学键的形成可有效提高纸张（板）的湿强度；另一方面，从前述分析可以推断，漆酶的作用会使处理纸浆过程中加入的小分子酚类物质发生缩合反应，缩合的木素沉积并“包裹”在纤维表面即与纤维表面木素进一步发生化学键连接，这增加了漆酶对纤维表面木素的可及度和纤维表面的改性程度，使纸浆湿强度得到提高。

表3 不同处理方式对OCC纸浆成纸强度的影响

3 结论

3.1 GC-MS和GPC的测定表明APMP废液中含有对-甲氧基-苯酚、紫丁香醇和松柏醇，并且其与漆酶共同处理OCC纸浆过程中这些酚类物质参与反应，产物聚合，聚合的小分子酚类物质以缩合木素的形式沉积在纤维表面，增加了纤维表面木素含量，从而提高了纸浆强度，特别是湿环压强度提高较为明显。

3.2 APMP废液中的小分子酚类物质可以与漆酶共同改善OCC纸浆的纤维性能，为酶法解决废液中酚类物质造成的DCS积累等问题提供理论依据，同时，也为利用生物技术改善循环废液的性能提供了参考。

3.3 漆酶与废液中酚类物质共同改善OCC纸浆性质为提高瓦楞纸板的环压强度提供了一个方法，且有利于进一步推进漆酶工业化应用。

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