气相色谱－串联质谱法测定复合调味料中的微量苯甲酸

王祖翔 周洪斌 蒋 俊 沈 波

（江苏镇江出入境检验检疫局，江苏 镇江 212008）

气相色谱－串联质谱法测定复合调味料中的微量苯甲酸

王祖翔 周洪斌 蒋 俊 沈 波

（江苏镇江出入境检验检疫局，江苏 镇江 212008）

建立高盐高氨基酸复合调味料中微量苯甲酸的气相色谱毛细管色谱柱检测方法。调节样品水溶液至酸性而改变其在有机相和水相中分配比。用乙醚高速匀浆的方法多次提取，去除盐类和氨基酸等杂质后浓缩。苯甲酸用气相色谱毛细管色谱柱分离，FID检测器定量检测，质谱定性。结果表明：该方法在2.0～60.0mg/L的线性关系为R2＞0.999，最低检 测 限 （LOD）达 到 1.0mg/kg，定 量 限 （LOQ）为3.0mg/kg，检出限加标回收率在89.0%～99.2%，其相对标准偏差（RSD）＜5%。说明该方法具有高灵敏性和专属性，能对微量苯甲酸进行准确定性和定量检测，是行之有效的检测方法。

气相色谱－质谱联用；苯甲酸；复合调味料

苯甲酸是最常用的防腐剂之一，在一定条件下能对霉菌和酵母菌的繁殖起到抑制作用，起到延长食品保存时间的功效，是大多数国家允许使用的食品防腐剂，但过量食用对人体有害，因而，许多国家的食品卫生标准都规定了最大允许使用量［1］。在进出口贸易中，日本等国家对苯甲酸的限量要求极为苛刻，仅为1mg/kg。中国GB 2760——2007规定，复合调味料中苯甲酸的最大使用限量为600mg/kg［2］。GB/T 23495——2009方法规 定 的 苯 甲 酸 检 测 限 为 1.8mg/kg［3］；GB/T 5009.29——2003方法规定的苯甲酸的检测限为1mg/kg［4］。

当前，国内外测定防腐剂的方法有很多，如光谱法、毛细管电泳法、离子色谱法、分光光度法等［5－9］，使用最多的是色谱法，并有大量文献报道［10－13］，但未见复合调味料中低含量苯甲酸检测的相关资料。复合调味料基质复杂，含高盐高氨基酸，干扰严重，检出限远高于标准规定，且极易出现假阳性，不能满足低残留量苯甲酸的检测要求，必须经质谱定性。许秀敏等［14］曾报道液相色谱－质谱联用仪进行定性分析，液相色谱紫外检测器进行定量分析。本试验基于2010年度中国进出口食品安全卫生残留计划中对复合调味料中苯甲酸的检测要求，使用气相色谱－串联质谱仪，FID定量检测，并用质谱进行定性确证。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

石油醚，乙醚，无水硫酸钠，氯化钠，盐酸：分析纯，南京化学试剂一厂；

水：一级水，优普超纯水机制备；

衍生化试剂：双三甲基硅基三氟乙酰胺（BSTFA）＋三甲基氯硅烷（TMCS）（99＋1），美国REGIS公司；

苯甲酸标准品：纯度≥99%，德国Dr Ehrenstorfer公司。

1.2 试验仪器

7890N气相色谱仪配氢火焰离子化检测器（FID）－串联5975CInert MS质谱：美国Agilent公司；

旋涡混匀器：XW－80A，上海医科大学仪器厂；

旋转蒸发仪：BuCHI R－200，瑞士BuCHI公司；

台式高速冷冻离心机：H2050R，湖南湘仪离心机仪器有限公司；

高纯度氢气发生器：SJPH－300A，北京中惠普分析技术研究所；

超纯水机：UPH－IV－20T，南京优普环保设备有限公司；

氮吹仪：TuboVap LV，美国Caliper公司。

1.3 试验方法

1.3.1 FID定量 色谱柱：HP－innowax（30m×0.25mm×0.25μm）；氮气流速：1mL/min；进样口温度：250℃；检测器温度：250℃；柱温：100℃保持1min，40℃/min升至180℃保持2min，10℃/min升至230℃保持2min，10℃/min升至240℃保持2min，10℃/min升至250℃保持10min。进样方式：分流；分流比：20∶1。进样量：1μL。

1.3.2 MSD定性确证

（1）色谱条件：色谱柱：DB－5MS UI（30m×0.25mm×0.25μm）；氦气流速：1mL/min；进样口温度：260℃；柱温：80℃保持3min，30℃/min升至300℃保持2min；接口温度：280℃；进样方式：不分流；进样量：1μL。

（2）质谱条件：离子源：150℃，四级杆：230℃，scan模式全扫描，溶剂延时5min。

1.3.3 标准溶液配制 准确称取苯甲酸标准品各0.100 0g，石油醚＋乙醚（3＋1）混合溶剂溶解，定容至100mL，此混合溶液每毫升相当于1.0mg苯甲酸。再移取10mL浓度为1.0mg/mL的标准溶液于100mL容量瓶中石油醚＋乙醚（3＋1）混合溶剂定容，如此稀释成10μg/mL的苯甲酸混合标准溶液。分别移取2.0，5.0，10.0，20.0，40.0，60.0mL浓度为10μg/mL的混合标准溶液于10mL容量瓶中，石油醚＋乙醚（3＋1）混合溶剂定容，得到2.0，5.0，10.0，20.0，40.0，60.0μg/mL不同浓度梯度苯甲酸标准溶液系列。

1.3.4 样品处理 准确称取5.0g试样，置于50mL聚四氟乙烯离心管中，加盐酸（1＋1）酸化，调节pH值1到2之间，用20mL乙醚涡旋提取1min，4 000r/min离心5min，收集乙醚层于30mL玻璃试管中，40℃水浴上氮气吹干。再用20mL乙醚涡旋提取1min，4 000r/min离心5min，收集乙醚层于同一玻璃试管中，40℃水浴上氮气吹干。用10mL乙醚，将30mL玻璃管中残渣洗入10mL玻璃试管中，40℃水浴上氮气吹干。准确移入1mL石油醚＋乙醚（3＋1）混合溶剂溶解残渣，得到待测液。

1.3.5 样品测定 按照1.3.4进行样品前处理，1.3.1和1.3.2条件进行定量测定和定性确证。

2 结果与讨论

2.1 线性回归方程

对浓度为5.0，10.0，20.0，40.0，60.0，80.0μg/mL的标准溶液进行分析（标准品分离色谱图见图1），得到质量浓度X与峰面积Y的工作曲线，线性与相关系数良好。回归方程为：Y＝47 923X－28 805；线性相关系数R2＝0.999 6。苯甲酸标准品出峰时间：10.941min。

图1 实际样品局部色谱图（FID）Figure 1 Partial chromatogram of real samples（FID）

2.2 检测低限

按色谱峰高是基线噪声高度3倍为有效信号计算检出限（LOD），在本试验条件下，苯甲酸的检出限为1mg/kg；基线噪声高度10倍为有效信号计算定量限（LOQ），在本试验条件下，苯甲酸的定量限为3mg/kg。

2.3 加标回收试验和精密度计算

将待测样品和加标样品进行6次试验，对所得的试验结果计算精密度，具体结果见表1，样品色谱图见图1。

表1 苯甲酸在不同添加水平下的回收率和相对标准偏差Table 1 Recoveries and RSDs of benzoic acid spiked at differentl evels（n＝6）

采用加标测定回收率的方法来计算准确度。将浓度适当的标准溶液按本试验所述方法进行测定，回收率为80%～98%。

2.4 前处理优化

苯甲酸为弱酸，pKa值为4.76，在酸性条件下（pH在1到2之间），以酸的形式存在，易溶于石油醚和乙醚。复合调味料基质复杂，提取过程中需加入酸来抑制电离，减少在水相中的分配比。按GB/T 5009.29——2003第一法所用的盐酸量不足以使试样呈酸性，苯甲酸在电离状态下在水相中溶解度较大，严重降低乙醚萃取效率，故本试验加大盐酸溶液用量，最终以调节试样溶液pH值来决定盐酸溶液用量。

2.5 质谱定性试验

按1.3.4处理的待测液，用1.3.2的色谱和质谱条件进行试验，从总离子流图中提取122、105、77、51四离子，得到提取离子色谱图（图2），扣除背景后得到质谱图（图3）与标准谱库中的苯甲酸匹配度为98%。

图2 样品提取离子色谱图Figure 2 Extracted ion chromatograms

图3 提取离子的质谱图Figure 3 Extracted ion mass spectrum

2.6 柱前硅烷化衍生

甘平胜等［15］利用质谱的高灵敏度和高选择性，直接对奶粉中低含量残留的苯甲酸定性定量。在质谱定性确证试验中，还发现部分苯甲酸被硅烷化后的产物。试验结果表明苯甲酸的羟基氢活性较强，有可能被毛细管柱填料的硅烷基取代，峰型严重拖尾、重复性和线性相关性很差，难以准确定量。

取10μg/mL苯甲酸标品溶液100μL，氮气吹干，加入300μL吡啶和200μL衍生化试剂，70℃水浴反应40min，供GC－MSD检测。色谱条件：色谱柱：HP－5MS（30m×250μm ×0.25μm）；柱温：110℃保持4min，30℃/min升至180℃保持3min；氦气流速：1mL/min；进样口温度：280℃；接口温度：280℃；进样方式：不分流；进样量：1μL。硅烷化后的特征离子有179、135、105、77、121等，峰形有较大改善，灵敏度提高，重复性良好，可以建立为痕量苯甲酸残留的定量检测方法，提取离子图和质谱图见图4和图5。

图4 衍生后的提取离子色谱图Figure 4 Extracted ion chromatograms of derivatized

图5 衍生后的质谱图Figure 5 Mass spectrum of derivatized

3 结论

本试验基于气相色谱法检测苯甲酸的基础上，对前处理优化，建立了一种高效、快速的利用气相色谱法检测复合调味料中苯甲酸微量残留的检测方法，并使用质谱进行定性确证，防止了假阳性的产生。该方法有效解决了基质复杂，高盐高氨基酸样品中微量苯甲酸残留的检测困难，其精密度、准确度、稳定性都可以满足日常检测工作的需要，适宜其他样品的日常检测。

1 张红，陈子雷，王文博，等.肉制品中山梨酸、苯甲酸的气相色谱分析方法的研究［J］.食品科技，2007（2）：234.

2 中华人民共和国卫生部.GB2760——2007食品添加剂使用卫生标准［S］.北京：中国标准出版社，2008.

3 国家质量监督检验检疫总局.GB/T 23495——2009食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定 高效液相色谱法［S］.北京：中国标准出版社，2009.

4 中华人民共和国卫生部.GB/T5009.129——2003食品中山梨酸、苯甲酸的测定［S］.北京：中国标准出版社，2004.

5 Campos C，Gerschenson L N，Alzamora S M，et al.Determination of sorbic acid in raw beef：An improved procedure［J］.Food Sci，1991，56（3）：863.

6 K C Waldron，Li J.Investigation of a pulsed－laser thermo－optical absorbance detector for the determination of food preservatives separated by capillary electrophoresis［J］.J.Chromatogr：B，1996，683（1）：47～54.

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8 Xie Y T，Chen P，Wei W Z.Rapid analysis of preservatives in beverages by ion chromatography with series piezoelectric quartz crystal as aetector［J］.Microchem，1999，61（1）：58～68.

9 桑宏庆，蔡华珍，王大勇.紫外分光光度法同时测定饮料中山梨酸钾和苯甲酸钠［J］.检测与分析，2006.8（9）：34～35.

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12 陈子雷，张红，王文博，等.气相色谱法测定糕点中山梨酸和苯甲酸的含量［J］.食品与药品，2006，11（8）：52～54.

13 Fernando J M Mota，Isabel M P L V O Ferreira，Sara C Cunha，et al.Optimisation of extraction procedures for analysis of benzoic and sorbic acids in foodstuffs［J］.Food Chemistry，2003，82（3）：469～473.

14 许秀敏，吴西梅，梁春穗，等.液相色谱－质谱联用检测食品中苯甲酸、山梨酸、糖精钠［J］.中国卫生检验杂志，2005，15（9）：1 057.

15 甘平胜，黄聪，于鸿，等.气相色谱－质谱联用法测定奶粉中苯甲酸（钠）含量［J］.中国卫生检验杂志，2008，18（1）：75～76.

Study on the trace determination of benzoic acid in compound seasoning powder by gas chromatography－tandem mass spectrometry

WANG Zu－xiang ZHOU Hong－bin JIANG JunSHEN Bo

（Zhenjiang Entry－Exit Inspection and Quarantine Bureau，Zhenjiang，Jiangsu212008，China）

To establish a method of capillary gas chromatography for the determination of benzoic acid in compound seasoning powder which contain high concentrations of salts and amino acids.Change the distribution ratio of samples in the organic phase and water by adjusting the solution to acidic.The sample was mashed several times at a high speed，and extracted with diethyl ether then concentrated after removed impurities such as salts and amino acid.Benzoic acid was separated by GC with capillary column，detected quantitatively by FID and identified by mass.Within the concentrations of 2.0～60.0mg/L，the calibration curve showed good linearity with the correlation coefficient（R2）＞0.998.The limit of detection（LOD）was 1.0mg/kg，while the limit of quantification（LOQ）3.0mg/kg.At the spiked levels of LOD，the recovery rate was 89.0%～99.2%.The relative standard deviation range of samples added standard substance was（RSD）＜5%.This method is sensitive and special features in identify and determination of trace benzoic acid.It is a feasible method.

GC－MSD；benzoic acid；compound seasoning powder

10.3969/j.issn.1003－5788.2011.03.026

王祖翔（1983－），男，江苏镇江出入境检验检疫局助理工程师。E－mail：wang＿zuxiang＠163.com

2011－03－11