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禁食对东方蝾螈胃肠道5-羟色胺细胞形态和分布型的影响

2011-12-15刘家举张志强

关键词:蝾螈胃体羟色胺

刘家举 张志强

禁食对东方蝾螈胃肠道5-羟色胺细胞形态和分布型的影响

刘家举 张志强*

(安徽农业大学动物科技学院,合肥230036)

目的 禁食对东方嵘螈(Cynops orientalis)胃肠道5-羟色胺细胞形态学特点和分布密度的影响。方法 SP(streptavidin peroxidase)免疫组织化学方法。结果 喂食组东方蝾螈胃肠道5-羟色胺开放型和闭合型细胞的比值高峰为幽门和十二指肠,直肠其次,其余部位较为接近;禁食组幽门最高,十二指肠其次,贲门、空肠、回肠和直肠最低。禁食组胃体和空肠的比值高于喂食组,回肠低于喂食组,其余部位无组间差异。喂食组幽门和直肠的分布密度最高,胃体最低;禁食后,十二指肠的分布密度最高,贲门和回肠最低。禁食组胃体的分布密度显著高于喂食组,其余部位无组间差异。结论 东方蝾螈可通过胃体、空肠和回肠开放型5-羟色胺细胞数量的调整及胃体分布密度的增加来调节禁食后胃肠道的消化和吸收能力。

禁食; 东方蝾螈; 胃肠道; 5-羟色胺细胞; 分布密度

5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)免疫活性细胞属内分泌细胞类,对消化功能具有很强的调节作用[1]。目前,通过使用哺乳类5-HT抗血清,已对多个类群的脊椎动物做过定位和鉴别研究[1-3],关于两栖类已有较多报道,但多集中于无尾类动物[4-19],除对无斑肥螈(Pachytriton labiatum)[20]的消化道、黑斑蝾螈(Triturus vulgaris)和冠北螈(Triturus cristatus)[21]的肠道进行过定位研究外,在有尾类中尚无其他报道。这些研究表明,两栖类消化道5-HT细胞可分为闭合型和开放型两种类型[3-1],两种细胞的比值从十二指肠至直肠呈逐渐降低的趋势[21],多数种类在胃幽门部密度最高,食道和/或直肠处密度最低[3–10,20],但分布型也有明显的种间差异[11-17],这可能与动物的食性或消化生理状态有关。处于饥饿状态的太行隆肛蛙(Paa taihangnicus)[8],其胃肠道5-HT细胞的分布密度具有胃幽门部和小肠两个峰值,但饱食状态只在胃幽门部有一个峰值;禁食15天后,黑斑蛙(Pelophylax nigromaculata)的食道、胃贲门部和胃体5-HT细胞的密度低于喂食组,但其余部位无组间差异[6]。东方嵘螈(Cynops orientalis)隶属于两栖纲有尾目,禁食状态下,它通过调整胃肠道前后端内分泌细胞的总数来适应短时间的饥饿状态[22],本文进一步采用免疫组织化学方法,比较了正常取食和禁食状态下胃肠道主要的内分泌细胞类型—5-HT细胞的形态学特点和分布密度的变化,拟从组织学和细胞化学的角度阐明禁食对其胃肠道消化和吸收能力的影响。

材料和方法

1.材料

2010年3月于合肥市裕丰花市购买东方蝾螈12只,暂养于60 cm ×30 cm ×40 cm的水族箱内。用报纸遮住水族箱四周,自然光照,以孑孓为食,每隔3天换水一次,保持水质清澈。一个月后,随机取出6只动物,称量体重和体长后,用双毁髓法处死动物,迅速取出胃肠道,用0.1 mol/l PBS清洗后,按胃贲门部、胃体、胃幽门部、十二指肠、空肠、回肠和直肠取材,每段截取0.5-1 cm长的组织块。用无冰醋酸的Bouin’S液固定组织块18-24 h,常规脱水透明,石蜡包埋,切片(6μm)。剩余的6只动物做禁食处理,共处理15天,胃肠道的取材和切片方法同喂食组。

2.主要试剂

即用型(ready to use)5-HT抗血清(兔抗人)和链霉菌抗生物素蛋白一过氧化物酶免疫组织化学试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司,由美国ZYMED公司生产,产品代号为ZA-0231。

3.免疫组织化学方法

常规石蜡切片脱蜡至水。用0.3%H2O2甲醇溶液孵育15 min,0.01mol/L PBS冲洗3次 ×5 min,滴加正常山羊血清,37℃孵育15 min,吸去多余血清,滴加一抗,4℃过夜。PBS洗涤 3次 ×5 min,滴加即用型生物素标记的二抗 (羊抗兔Ig G抗血清),37℃孵育15 min。PBS洗涤3次×5 min,滴加即用型链霉菌抗生物素蛋白—过氧化物酶,37℃孵育20 min。PBS浸洗3次×5 min,DAB-H2O2显色,蒸馏水冲洗,脱水,透明,封片。阴性对照,分别以正常羊血清和PBS代替一抗,其余步骤同上。

4.观察与细胞计数

在Motic-BA 210型显微镜下观察,拍照,计数。对每只东方蝾螈胃肠道的每个取材部位,取相距至少5张且组织结构完整的切片5张,每张切片随机取10个400倍视野计数,取10个视野的平均值表示每张切片上5-HT细胞的数量,再以5张切片的平均值表示该只动物该部位的数量,最后以6只动物各部位的平均值表示喂食组或禁食组胃肠道每一部位5-HT细胞的总数量、开放型细胞的数量和闭合型细胞的数量

5.统计学分析

用SPSS 11.5 for windows进行数据处理。经Kolmogorov-Simirnov test检验,所有数据均符合正态分布。用独立样本 t-检验(independent-samples t-test)比较喂食组与禁食组动物的体重和体长,以及胃肠道各部位开放型与闭合型细胞的比值及5-HT细胞密度的组间差异。以单因素方差分析(one-way ANOVA)及多重比较(multiple comparisons)post hoc test统计喂食组和禁食组组内胃肠道各部位开放型和闭合型细胞的比值及5-HT细胞的分布密度的差异。文中数据均以平均值 ±标准误(mean±SE)表示,P<0.05为差异显著,P<0.01为差异极显著。

结 果

禁食组东方蝾螈的平均体重为1.47±0.12 g,显著低于喂食组(2.64±0.26 g)(t=4.04,P<0.01),但体长无组间差异(喂食组:71.79±2.41 mm,禁食组:64.56±2.29 mm;t=2.17,P>0.05)。

1.禁食对5-HT细胞形态学特点的影响

喂食组东方蝾螈胃肠道开放型和闭合型细胞的比值高峰为幽门和十二指肠,直肠其次,胃体和空肠最低(F6,35=9.700,P<0.05);禁食组幽门最高,十二指肠其次,贲门、空肠、回肠和直肠最低(F6,35=8.483,P<0.05)。禁食组胃体和空肠的比值高于喂食组,回肠低于喂食组,其余部位无组间差异。(表1)

喂食组贲门的5-HT细胞主要分布于腺泡上皮、腺泡细胞或胃上皮细胞之间,细胞呈圆形或椭圆形(图1);胃体和幽门的5-HT细胞主要分布于腺泡上皮之间或上皮基部,少数细胞呈锥形或梭形(图2、3);十二指肠的5-HT细胞位于上皮基部,细胞呈圆形(图4)或锥体形;空肠的5-HT细胞位于上皮基部或上皮细胞之间,细胞呈椭圆形或圆形(图5);回肠和直肠的5-HT细胞位于上皮基部,细胞呈锥形、梭形或圆形(图 6、7)。

禁食组贲门和幽门5-HT细胞的分布位置和形态学特征与喂食组相似,胃体多数细胞为锥体形(图8-10)。十二指肠的5-HT细胞主要分布于上皮细胞之间,细胞呈锥形、长楔形(图 11、12)或圆形;空肠的5-HT细胞主要分布于分布于上皮基部或上皮细胞之间,细胞呈棒状或楔形(图13);回肠和直肠的5-HT细胞主要分布于上皮基部,细胞呈圆形或锥形(图 14、15)。

表1 东方蝾螈喂食组与禁食组胃肠道各部位开放型与闭合型5-羟色胺细胞的比值Table 1 Ratio between open and closed populations of 5-hydroxytryptamine-producing cells along the different regions of gastrointestine of Cynop s orientalis in both feeding and fasting group s

2.禁食对5-HT细胞分布密度的影响

喂食组5-HT细胞在幽门和直肠处分布密度最高,贲门、十二指肠、空肠和回肠居中,胃体最低(F6,35=4.095,P<0.05);禁食后,5-HT细胞在十二指肠处分布密度最高,胃体、幽门和空肠居中,贲门和回肠最低(F6,35=3.983,P<0.05)。禁食组胃体的分布密度显著高于喂食组,其余部位无差异。(表2)

表2 喂食组与禁食组东方蝾螈胃肠道5-羟色胺细胞的分布密度Table 2 The distributive density of 5-hydroxytryptamine cells along the gastrointestine of Cynops orientalis in both feeding and fasting groups

讨 论

东方蝾螈禁食组回肠开放型和闭合型5-HT细胞的比值低于喂食组,胃体和空肠高于喂食组;胃体5-HT细胞的分布密度高于喂食组。这说明,禁食可影响东方蝾螈胃肠道5-HT细胞的形态学特征和分布型,东方蝾螈可通过调整5-HT细胞形态的改变和分泌强度的变化来调节胃肠道的消化和吸收能力。

喂食组东方蝾螈5-HT细胞在幽门和直肠分布密度最高,胃体最低。多数两栖动物消化道5-HT细胞集中分布于幽门,在食道和/或直肠处最低[2-9],也有一些种类分布密度高峰位于胃贲门部[11,12]、胃体[13]、十二指肠[14]、空肠[15,16]或回肠[6]。东方嵘螈喂食组5-HT细胞的分布型不同于已研究过的无尾类动物[2-18],与有尾类动物也有差异[19-20]。无斑肥螈在幽门的密度最高,食道、贲门和直肠最低[19],黑斑蝾螈和冠北螈的肠道均在十二指肠和直肠具有较高的分布密度,空肠和回肠较低[20]。东方嵘螈喜食孑孓、水蚯蚓、面包虫等昆虫,生活在山间或山麓的静水处,平时在水底或水草下面,一般隔几分钟需游至水面进行呼吸;无斑肥螈体形较大,主要捕食石蝇、螺类、虾、蟹等小动物,以水栖生活为主,白天多栖于石下,夜晚多在水底石上爬行。两者的生活环境相似,食性可能是影响5-HT细胞分布型不同的主要原因。

禁食使东方蝾螈5-HT细胞的形态和分布型发生了改变。5-HT主要由肠粘膜层的嗜铬细胞分泌产生,物理刺激和化学信号均能促进其分泌[1]。喂食组东方蝾螈开放型和闭合型细胞的比值高峰为幽门和十二指肠,胃体和空肠最低。这与胃部有大量完整的未被消化的食物有关,机械刺激虽能促进5-HT细胞的分泌,但东方蝾螈可能尚未启动消化程序;在解剖东方蝾螈的胃肠道时,其空肠段未见食物,开放型细胞的数量下降与5-HT细胞对胃肠道的调节功能是相一致的。禁食后,开放型和闭合型细胞的比值在幽门最高,十二指肠和胃体其次,贲门等部位最低,这与饥饿状态下,食物的机械刺激减弱或消失,肠道对食靡的消化吸收能力增强有关。禁食组胃体和空肠的比值高于喂食组,回肠的比值低于喂食组,说明胃体、空肠和回肠能维持较高水平的功能状态,保持对饥饿的适应和调整能力。一旦解除饥饿状态,东方蝾螈可能通过调整5-HT细胞的形态学特征来调节胃肠道的运动和促进消化吸收过程。东方蝾螈禁食后5-HT细胞的分布型与太行隆肛蛙相似[7],但后者只在胃幽门部和十二指肠处密度略有下降,其余部位呈上升趋势[7]。无论饱食或饥饿状态,黑斑蛙5-HT细胞的分布型均未发生显著改变,但禁食组贲门和胃体的密度都低于喂食组[5]。这说明,两栖动物对饥饿的反应可能具有物种特异性,胃肠道作为弹性器官,可通过5-HT细胞分布型的改变来适应食物短缺的环境。

总之,禁食处理可影响东方蝾螈胃肠道5-HT细胞的形态学特征和分布型。饥饿时,东方蝾螈可通过增加胃体和空肠开放型5-HT细胞的数量、减少回肠开放型5-HT细胞的数量及增加胃体分布密度的方式来调节禁食后胃肠道的消化和吸收能力,这种改变可能受禁食时间长短的影响。

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图 版 说 明

图1 喂食组胃贲门部椭圆形的5-HT细胞。S-P法,×400

图2 喂食组胃体锥形的5-HT细胞。S-P法,×400

图3 喂食组胃幽门部锥形的5-HT细胞。S-P法,×400

图4 喂食组十二指肠圆形的5-HT细胞。S-P法,×400

图5 喂食组空肠椭圆形的5-HT细胞。S-P法,×400

图6 喂食组回肠梭形的5-HT细胞。S-P法,×400

图7 喂食组直肠圆形和长梭形的5-HT细胞。S-P法,×400

图8 禁食组胃贲门部椭圆形的5-HT细胞。S-P法,×400

图9 禁食组胃体锥形的5-HT细胞。S-P法,×400

图10 禁食组胃幽门部椭圆形和梭形的5-HT细胞。S-P法 ,×400

图11 禁食组十二指肠锥形的5-HT细胞。S-P法,×400

图12 禁食组十二指肠长梭形的5-HT细胞。S-P法,×400

图13 禁食组空肠棒状和圆形的5-HT细胞。S-P法,×400

图14 禁食组回肠圆形的5-HT细胞。S-P法,×400

图15 禁食组直肠圆形和锥体形的5-HT细胞。S-P法,×400

EXPLANATIONOF FIGURES

Fig.1 Ellipse shaped 5-HT cells in the caidia of feeding

group.S-P method,×400

Fig.2 Cone shaped 5-HT cells in the body of stomach of feeding group.S-P method,×400

Fig.3 Cone shaped 5-HT cells in the pylorus of feeding group.S-P method,×400

Fig.4 Round shaped 5-HT cells in the duodenum of feeding group.S-P method,×400

Fig.5 Ellipse shaped 5-HT immunoreactive cells in the jejunum of feeding group.S-P method,×400

Fig.6 Shuttle shaped 5-HT cells in the ileum of feeding group.S-P method,×400

Fig.7 Round and long shuttle shaped 5-HT cells in the rectum of feeding group.S-P method,×400

Fig.8 Ellipse shaped 5-HT cells in the caidia of fasting group.S-P method,×400

Fig.9 Cone-shaped 5-HT cells in the body of stomach of fasting group.S-P method,×400

Fig.1 0 Ellipse and shuttle shaped 5-HT cells in the pylorus of fasting group.S-P method,×400

Fig.1 1 Cone shaped 5-HT cells in the duodenum of fasting group.S-P method,×400

Fig.1 2 Long wedge shaped 5-HT cells in the duodenum of fasting group.S-P method,×400

Fig.1 3 Bar and round shaped 5-HT cells in the ileum of fasting group.S-P method,×400

Fig.1 4 Ellipse shaped 5-HT cells in the rectum of fasting group.S-P method,×400

Fig.1 4 Round shaped 5-HT cells in the ileum of fasting group.S-P method,×400

Fig.1 5 Round and cone shaped 5-HT cells in the rectum of

fasting group.S-P method,×400

EP:上皮 (epithelium)SG:胃腺 (stomach gland)标尺 (scale)=10μm

Effects of fasting on mor phology and distr ibutive mode of 5-hydroxytryptamine cells along the gastrointestinal tract of cynops or ientalis

Liu Jiaju,Zhang Zhiqiang*
(School of Animal Science and Technology,Anhui Agricultural University,Hef ei 230036,China)

Objective To study the effects of fasting on the morphological features and distributive density of 5-hydroxytryptamine(5-HT)cells along the gastrointestinal tract of Cynops orientalis.Methods Streptavidin-peroxidase immunohistochemical method was used.Results The ratio between open and closed type 5-HT cells was the highest in pylorus and duodenum,secondary in rectum,and the lowest in other portions with a similar distributive density in the feeding group.In the fasting group,it was the highest in pylorus,secondary in duodenum,and the lowest in cardia,jejunum,ileum and rectum.The ratio was higher in f undus and jejunum in the fasting group than in the feeding group,lower in the ileum,but not different in other portions.5-HT cells in feeding group showed the highest density in pylorus and rectum,and the lowest in the f undus;in the fasting group,the highest density was in the duodenum,and the lowest in cardia and ileum.The distributive density of 5-HT cells in f undus was higher in the fasting group than in the feeding group,but not different in other portions.Conclusion Cynops orientalis may mainly rely on the changed number of open type 5-HT cellsin the regionsof f undus,jejunum and ileum,as well as the increased distributive density in thef undus to regulate the digestive and absorptive capacity during fasting period.

Fasting; Cynops orientalis; Gastrointestine; 5-Hydroxytryptamine cells; Density

R322.44 R322.45

A

10.3870/zgzzhx.2011.03.009

2010-07-20

2010-12-01

安徽农业大学稳定人才基金项目(wd-2010-02)

刘家举,男 (1986年),汉族,硕士研究生。

*通讯作者(To whom correspondence should be addressed)

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