脊髓源神经干细胞诱导分化为胆碱能神经元过程中Aldoc和Stmn1表达的研究

刘彩玉 王春芳＊ 李鹏飞 蔚洪恩 龙志晶 邓春圣

脊髓源神经干细胞诱导分化为胆碱能神经元过程中Aldoc和Stmn1表达的研究

刘彩玉1王春芳1＊李鹏飞1蔚洪恩1龙志晶1邓春圣2＊

(1山西医科大学生物技术教研室,太原030001;2中国人民解放军第322医院,山西大同037006)

目的 探讨脊髓源神经干细胞在诱导分化为胆碱能神经元过程中Aldoc和Stmn1的表达变化情况。方法 从孕17天Wistar胚胎大鼠取出脊髓组织,制成细胞悬液,采用含EGF和bFGF的无血清限定性培养基培养,然后进行诱导分化,观察脊髓源神经干细胞向胆碱能神经元分化的情况,应用荧光定量PCR方法分析Aldoc和Stmn1基因在脊髓源神经干细胞诱导分化为胆碱能神经元的过程中的表达变化情况。结果 神经干细胞在诱导分化为胆碱能神经元后,经免疫荧光检测有ChAT阳性细胞表达;Aldoc基因的表达量在胆碱能神经元较神经干细胞低(P<0.05);Stmn1基因的表达量则在诱导分化后较神经干细胞升高(P<0.05)。结论 Aldoc对神经干细胞的干性维持有重要作用,Stmn1在胆碱能神经元的成熟过程中起作用。

神经干细胞; 胆碱能神经元; Aldoc基因; Stmn1基因; 基因表达

神经干细胞(neural stem cell,NSCs)是一类具有分裂潜能和自我更新能力的母细胞,它可以通过不对等的分裂方式产生神经组织的各类细胞,且在体外自然分化的条件下神经干细胞也具有多向分化潜能,可分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。近年来随着神经干细胞的发现和逐步了解,人们开始希望能通过神经干细胞来治疗脊髓损伤,其定向分化性,为修复和替代死亡的神经细胞提供了可能。报道称,在脊髓多层面NSC的移植可作为运动神经元疾病将来的细胞治疗策略[1],Wichterle等模拟体内运动神经元分化的途径,在体外用 RA、SHH诱导鼠胚胎干细胞先向脊髓祖细胞分化,进而诱导脊髓祖细胞向运动神经元分化,最终有20%-30%的细胞表达运动神经元的标记物 Hb9[2]。运动神经元是胆碱能神经元的一种,胆碱能神经元是神经系统中分泌乙酰胆碱的神经元的通称,本课题组在近来研究中发现,通过RA和SHH的联合使用,诱导脊髓源性神经干细胞分化,所得细胞可表达ChA T[3](ChA T是胆碱能神经元的重要标记之一),虽然已经证实,神经干细胞在体内能够沿着既定的路线增殖发育成各种神经细胞主要是受基因调控的[4],但其定向分化为胆碱能神经元的分子机制仍不清楚。研究显示,Aldoc(Aldolase C)能够参与神经胚的形成[5],而stmn1(stathmin1)能够参与神经元的增殖与分化[6],本实验就NSCs诱导分化为胆碱能神经元的过程中Aldoc与stmn1的变化情况进行了研究。

材料和方法

1.试剂

DMEM/F12(Gibco);B27(Sigma);视黄酸(RA,Sigma);碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养因子-3(NT-3)、音猬因子(SHH)(均购至R&D);胎牛血清(四季青);Nestin抗体(rabbit anti-rat nestin)(Santa Cruz);ChA T抗体(mouse anti-rat ChA T,Chemicon);Cy3标记的羊抗兔二抗、Cy3标记的兔抗小鼠二抗(GE);RT-PCR试剂(Ta KaRa);实时定量 PCR试剂盒 TaqMan Micro RNA Assays(Applied Biosystems);CO2培养箱(Forma);低温高速离心机(Heraeus);Master-cycler型扩增仪(Eppendorf);ABI 7300型定量 PCR仪(Applied Biosystems);倒置显微镜(Olympus)。

2.NSCs的培养与鉴定

将孕龄17 d的Wistar大鼠用10%水合氯醛麻醉(按0.4 ml/100g的用量),用75%是酒精常规消毒孕鼠腹部,于无菌条件下取出胎鼠,放入预置DHank’s液的平皿中,去除胎膜及胎盘等组织,用显微器械取出胎鼠的脊髓组织,于解剖显微镜下仔细剥去脊髓外膜,在4℃预冷的D-Hank’s液中用吸管缓慢吹打数次,收集细胞滤液于离心管中,337 g离心5 min,弃去上清液,制备成细胞悬液,接种到限定性无血清培养液中,放37℃,5%CO2培养箱中原代培养,3d后更换培养液,以后每3d换液一次,待形成神经干细胞克隆球之后进行神经上皮干细胞巢蛋白(Nestin)免疫荧光检测。

3.脊髓源神经干细胞定向诱导分化为胆碱能神经元

取新鲜传代的第3代NSCs,轻柔吹打分散细胞球,以5×105个细胞/ml的密度接种于预先放置有多聚赖氨酸包被盖玻片的6孔板中,将培养板放入37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中让细胞球贴壁,4h后,轻轻吸去培养基,参照本课题组其他人的诱导方案,加入诱导培养基,第1 w:DMEM/F12+2%B27+20 ng/ml bFGF+2μM RA+50 ng/ml SHH,第2 w:DMEM/F12+2%B27+20 ng/ml b FGF+2μM RA+50 ng/ml SHH+20 ng/ml NT-3+20 ng/ml BDNF,对照组不加任何诱导剂,每2 d换液一次,在倒置显微镜观察细胞的分化情况,并拍照记录细胞的分化形态,在诱导分化2w后,用免疫荧光检测胆碱能神经元特异性标志物胆碱乙酰转移酶ChA T的表达。

4.细胞免疫荧光染色

分别将贴壁4 h后的神经干细胞和诱导分化2w后的神经细胞用4%的多聚甲醛室温固定20 min后,用含0.3%Triton 100.10%羊血清室温孵育30 min加一抗,4℃过夜,加二抗室温孵育2 h即可在荧光显微镜下观测。

5.RT-PCR检测基因表达

分别收集对照组(神经干细胞克隆球),诱导1w和诱导2w的细胞,吸去培养液,用 PBS液清洗一次,每孔细胞用 1 ml的 RNAiso Reagent试剂(Ta KaRa)按说明书进行操作提取总RNA,并以紫外分光光度计定量(OD260/OD280=1.8-2.0)。逆转录反应体系中含:2 g总 RNA;Oligo(d T)18(50 μM);5×M-MLV buffer;dNTP混合物(10 mM);RNase Inhibitor(40 U/l);RTaseM-MLV(RNase H-)(200 U/l)。42℃反应 1h,75℃冰上冷却15min。将所得cDNA于-20℃保存备用。PCR扩增引物均参照 GenBank mRNA序列,用ABI Primer express 3.0软件设计引物,由北京三博远志生物技术有限责任公司合成(序列见附表)。

PCR扩增体系 20 l中含:10 l 2×SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems),Real-time PCR引物1 l,cDNA产物1 l,dd H2O 8 l。在ABI7300定量PCR仪以如下条件进行扩增:95℃10 min,95℃15 s,60℃1 min,循环40次。反应设置4个复孔,以18S r RNA作为内参照。采用比较CT值法,应用 RQ Study软件(Applied Biosystems)进行miRNAs的相对定量分析。

6.统计学处理

实验数据实验数据用均数±标准差(¯x±s)表示,采用SPSS13.0统计分析软件进行t检验分析。

表1 18Sr RNA,Aldoc,Stmn1,ChA T基因的引物序列Table 1 Primer sequences of 18Sr RNA,Aldoc,Stmn1,ChA T for Real-time PCR

结 果

1.分离培养的NSCs的形态学特点

经分离培养的NSCs细胞,培养5-6 d后,光镜下可见几个或几十个细胞组成的悬浮微球,细胞呈群聚生长的状态,大小不一,折光性强,随着时间的推移,细胞球内的细胞数目在不断增长,细胞球的体积也随之增大,形态规则,呈球型或椭圆型,细胞排列紧密,无明显的突起。随着培养时间的增加,细胞球的体积就会保持稳定,不再增大(图1)。神经球Nestin免疫荧光标记结果显示神经球内的细胞胞浆都呈现强的红色荧光,表明所获得的神经干细胞呈Nestin抗原阳性(图2)。

2.NSCs诱导分化后形态学特点

神经干细胞接种于盖玻片上4 h后,神经干细胞球边缘有突起伸出,呈放射状。诱导3 d时,发现细胞突起明显增粗伸长。培养至第7 d,从神经干细胞球周围迁出许多细胞(图3),可见许多分化的细胞呈典型的神经元样细胞形态:胞体饱满而不规则,有多个细长突起。培养14 d时,大多数神经细胞已经从神经干细胞球中央迁出(图4),且神经细胞之间的突起相互交错呈网络结构(图5),免疫荧光检测可见细胞胞浆呈红色荧光,即有胆碱能神经元特异标志ChA T的阳性表达(图6)。

图1 培养14 d的神经干细胞球,形态规则,轮廓清楚,折光性强。标尺示50μm图2 免疫荧光染色显示,神经干细胞球内细胞胞浆呈Nestin阳性(红色)。标尺示40μm图3 诱导分化1 w后,一些细胞从神经干细胞球周围迁出,呈放射状。标尺示200μm图4 诱导分化2 w后,大多数神经细胞已经从神经干细胞球中央中迁出。标尺示100μm图5 诱导分化2w后,部分神经细胞之间的突起相互交错呈网络结构。标尺示100μm图6 诱导分化2w后,免疫荧光检测显示ChAT免疫反应阳性的胆碱能神经元之间的突起相互连接。标尺示80μmFig.1 Neural stem cell sphere was showed regular morphology with clear boundary and strong light ref ractivity after 14 days.bar=50μmFig.2 Fluorescent images of NSCs was showed the cytoplasm immunopositive for nestin(red).bar=40μmFig.3 After neural stem cells were differeted in 1w,some of them were migrated f rom neural stem cells sp here in shape of radial.bar=200μmFig.4 After neural stem cells were differeted in 2w,most of neural cells migrated from the centre of neual stem cell sphere.bar=100μmFig.5 Some neutites formed a net after 2w in differetiation.bar=100μmFig.6 Fluorescent imagesof ChAT-posibive cholinergic neurons complete neutites werefound after 2w in differetiation.bar=80μm

3.RT-PCR检测基因表达

实时定量PCR检测结果显示:Aldoc在诱导前后有变化,在诱导1w时其表达量比对照组低,诱导2 w时表达量仍较诱导1w时低(图7);Stmn1在诱导1w时表达量较对照组低,诱导2 w时表达较诱导1w组高,也显著高于对照组(图8);ChA T诱导2w后表达量比未诱导组高(图9);均存在统计学意义(P<0.05)。

图7 Aldoc相对定量结果:诱导1w时较对照组低,诱导2w时仍较1w时低。(A:1w;B:2w;C:对照)Fig.7 The relative quantitative resultsof target gene Aldoc:in comparison to control group,Aldoc was low-expressed after 1w,and still was low-expressed in comparison to 1w after 2w.(A:1w;B:2w;C:control)

图8 Stmn1相对定量结果:诱导1w时较对照组低,诱导2w时又较1w时高。(A:1w;B:2w;C:对照)Fig.8 The relative quantitative resultsof target gene Stmn1,in comparison to control group,Stmn1 was low-expressed after 1w,and was high-expressed in comparison to 1w after 2w.(A:1w;B:2w;C:control)

图9 ChAT相对定量结果:诱导2w后实验组较对照组高。(A:实验组;B:对照)Fig.9 The relative quantitative results of target gene ChA T,in comparison to control group,ChA T was high-expressed in experimental group after 2w.(A:experimental group;B:control)

讨 论

脊髓损伤所引起的运动神经元损伤是当今神经科学的重大难题,干细胞治疗具有良好的应用前景。但移植入脊髓的干细胞多分化为神经胶质细胞[7],由此我们在应用前先根据靶组织类型对神经干细胞进行定向诱导分化,因此神经干细胞定向诱导分化为所需神经元的分子机制成为关键问题。研究显示,在体外用 RA、SHH诱导胚胎干细胞向运动神经元分化,最终可表达运动神经元的标记物Hb9[8-9];同时本课题组也发现,通过RA和SHH的联合使用,诱导脊髓源性神经干细胞分化,所得细胞可表达 ChA T[3]。因此,实验中参考Li等人的方法[9],采用 RA、SHH、NF3和BDNF为诱导剂,诱导神经干细胞向胆碱能神经元分化。这些研究都是在观察诱导分化前后运动神经元标记基因的表达变化情况,而对细胞分化过程中分子机制的研究比较少。研究发现,Aldoc参与神经胚的形成[5],Stmn1参与神经元的增殖与分化[6],且本课题组前期对神经干细胞和运动神经元差异表达蛋白的研究也显示Aldoc在神经干细胞较运动神经元中高表达,Stmn1在运动神经元较神经干细胞中高表达,就此我们在本实验中观察了Aldoc和Stmn1在NSCs诱导分化为胆碱能神经元过程中的变化情况,进一步探讨神经干细胞的分化机制。

本实验研究发现:Aldoc在脊髓源神经干细胞诱导前后有变化,在诱导1w时其表达量比对照组低,诱导2w时表达量仍较诱导1w时低。Henriette等人发现Aldoc作为糖酵解酶的成员之一,能够为转录因子 Pax-6合成一个靶标,而 Pax-6与神经发育有紧密联系[5];且课题组前期对神经干细胞和运动神经元的差异蛋白研究中也显示Aldoc在运动神经元较干细胞表达低[10],由此我们推测Aldoc在参与神经胚形成的同时,可能对神经干细胞的干性维持有一定作用。

我们的实验结果显示Stmn1在诱导1w时表达量较对照组降低,诱导2w时表达较诱导1w组又升高。Stmn1作为微管蛋白调控基因,在早期的中央和周围神经系统高表达,可参与神经系统的发育[11],并且可以编码微管蛋白,对有丝分裂纺锤体的组装和消失有重要作用[12];但因其缺少Stmn2的N-末端同源区,故不能与CaMy1绑定,从而不能调控神经微管的形成[13]。而Stmn1能够通过绑定到其上的Ascl1与 b HL H家族的 Hes1基因作用,Hes1能够抑制Ascl1的表达,从而降低 Stmn1基因的表达,调控神经元的增殖与分化[14]。且课题组前期对神经干细胞和运动神经元的差异蛋白研究也显示Stmn1在运动神经元较神经干细胞表达高[10],而且有报道称Stmn1在神经元表达较高[15-16]。由此我们推断Stmn1可能是在脊髓源神经干细胞诱导分化为胆碱能神经元的后期,即胆碱能神经元的成熟过程中发挥作用。

通过实验研究,我们检测到Aldoc和Stmn1基因在NSCs分化中的表达变化情况,进一步使我们了解了神经干细胞向胆碱能神经元分化过程中的分子机制,可能对神经干细胞的移植和基因治疗的调控提供理论基础,为神经干细胞移植应用于脊髓损伤的修复奠定实验基础。

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The expression of Aldoc and Stmn1 during the differentiation of spinal cord-der ived neural stem cells into cholinergic neurons

Liu Caiyu1,Wang Chunfang1＊,Li Pengfei1,Wei Hongen1,Long Zhijing1,Deng Chunsheng2＊
(1Department of Biotechnology,Shanxi Medical University,Taiyuan 030001;2The 322nd Hospital of PLA,Datong Shanxi 037006 China)

Objective To detect the expression changes of Aldoc and Stmn1 gene during the differentiation of neural stem cells derived f rom the embryonic spinal cord into cholinergic neurons in rats.Methods The neural stem cells were harvested from the spinal cord of 17-day-old fetal rats,cultured in a serumf ree limited medium containing EGF and bFGF,and then induced by a conditioned medium.The real time quantitative PCR was used to detect the expression of Aldoc and Stmn1 mRNA during the differentiation.Results The cells were positive for ChA T by immunostaining analyses after the induction.The expression of Aldoc was decreased in cholinergic neurons(P<0.05);while the expression of Stmn1 was increased in cholinergic neurons(P<0.05).Conclusion Aldoc gene may play an important role in the maintenance of neural stem cells,whereas Stmn1 gene may play a role during the maturation process of cholinergic neurons.

Neural stem cell; Cholinergic neuron; Aldoc; Stmn1; Gene expression

R329

A

10.3870/zgzzhx.2011.03.010

2010-02-10

2011-04-01

山西省自然科学基金(2009011057-1);中国人民解放军第322医院自然科学基金(2011001)

刘彩玉,女(1984年),汉族,硕士研究生。

＊通讯作者(To whom correspondence should be addressed)