干扰骨髓基质细胞 Hes1基因对Mash1基因表达的影响

龙志晶 王春芳＊ 李鹏飞 刘彩玉 邓春圣 呼钟理

干扰骨髓基质细胞 Hes1基因对Mash1基因表达的影响

龙志晶1王春芳1＊李鹏飞1刘彩玉1邓春圣2＊呼钟理3

(1山西医科大学生物技术教研室,太原030001;2中国人民解放军第322医院,山西大同037006;3太原市中医医院,太原030002)

目的 观察对体外培养的骨髓基质细胞 Hes1基因干扰后Mash1基因的表达变化。方法 采用全骨髓培养法体外分离培养获得骨髓基质细胞,倒置显微镜下观察其形态变化,应用实时定量PCR技术分析在干扰 Hes1基因表达的情况下Mash1基因表达的变化。结果 应用200nM,100nM,50nM,25nM四种不同浓度梯度的Hes1的siRNA干扰抑制Hes1基因,与对照组相比 Hes1表达均降低。200nM干扰后 Hes1基因降低的程度是原来的0.036(P<0.05),50nM干扰后 Hes1基因降低的程度是原来的0.076(P<0.05),优于其他浓度的干扰效果。Hes1降低可使Mash1基因表达增加,且 Hes1降低越显著,Mash1表达增加越高。结论 体外培养BMSCs过程中干扰Hes1基因对Mash1基因的表达有影响,且呈负相关调控关系。

骨髓基质细胞; 基因表达; Hes1基因; Mash1基因; RNAi

在成体非神经组织源性神经干细胞研究中,骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)是近年来干细胞领域的研究热点,其具有干细胞自我更新、高度增殖能力和多向分化的潜能。有研究发现BMSCs在体内外特定条件下可以向多种间质细胞分化[1,2],还可以分化为神经元细胞[3]。因此,其又称骨髓基质细胞源神经干细胞(bone marrowderived neural stem cells)[4]。目前,BMSCs已成为一种理想的种子细胞,在神经再生领域有着广泛的应用前景,但其定向分化为神经元的分子调控机制仍不清楚。神经发育相关基因Hes1和Mash1基因属于b HL H蛋白家族,研究发现,它们广泛表达于发育中的外周和中枢神经系统[5]。Hes1(Hairy and enhancer of split 1)在维持神经干细胞增殖,分化为适当数量的细胞及分化的多样性方面具有重要的作用;Mash1(Mammalian achaete-scute homolog 1)作为其下游基因,参与了神经前体细胞的产生以及促进这些多潜能前体细胞向不同类型的神经元分化。本实验通过 RNAi技术在体外培养的大鼠BMSCs中干扰 Hes1基因的表达,观察Mash1基因的表达变化,了解在体外培养的BMSCs中 Hes1和Mash1两者之间的关系。

材料和方法

1.试剂

B27(Sigma),DMEM(Gibco),Opti-MEM(Sigma),LipofectimineTM2000 Reagent(Sigma),siRNA(Sigma),胎牛血清(杭州四季青公司),RT-PCR试剂(Takara),CD71山羊抗大鼠一抗(BOSTER),FITC标记的兔抗山羊二抗(BOSTER),超净工作台(苏净集团安泰公司,SW-CJ-1FD),低温高速离心机(美国 Heraeus),CO2培养箱(美国 Thermo Forma,3100),高压蒸汽消毒器(北京市永光明医疗仪器厂,GMSX-280),PCR扩增仪(美国 ABI,7300),相差显微镜(日本OL YMPUS,CK40)。

2.大鼠BMSCs的培养与鉴定

将120 g左右的雄性 Wistar大鼠腹腔注射1 ml肝素后,10%水合氯醛(0.4ml/100g)麻醉,用75%乙醇浸泡大鼠消毒10分钟,无菌条件下取出大鼠的股骨和胫骨,分别剪去股骨和胫骨的两端,用D-Hanks液冲洗骨髓腔2～3次,将提取的骨髓反复抽吸并制成细胞悬液。收集细胞悬液并转移至15 ml的离心管中,玻璃滴管吹打成单细胞悬液,1000 r/min,离心5 min后弃上清;将细胞沉淀用含10%胎牛血清的DM EM培养基悬浮,接种在六孔培养板中,在37℃、5%CO2孵箱内进行原代培养;3 d后更换培养液,除去未贴壁细胞,以后每3 d换液一次,待原代培养的细胞70%以上汇合时,用含0.25%胰酶的消化液消化细胞,并按1:2进行传代培养;传至第三代,用CD71免疫荧光技术鉴定细胞。

3.siRNA干扰

将新鲜传至P3代细胞转染前1～2天,用胰酶消化细胞并计数,使其在转染日密度为70～90%,细胞铺板在2 mlOpti-MEM培养基中;分别使用250μl Opti-M EM 稀释 siRNA 和 5μl的LipofectimineTM2000 Reagent试剂,室温孵育5分钟后,混合稀释的siRNA和稀释的LipofectimineTM2000 Reagent试剂,室温孵育20分钟;将复合物加入到每孔中,使 siRNA终浓度分别为200nM,100nM,50nM,25nM;6小时后更换为含血清含抗生素的正常培养基,在37℃的CO2孵箱中保温72小时。

4.总RNA的提取

分别收集未进行RNA干扰组和RNA高浓度干扰组、低浓度干扰组细胞进行对照,每孔细胞用1ml RNAiso Reagent试剂(Ta KaRa)按说明书进行操作提取总 RNA,并用紫外分光光度计定量(D260/D280=1.8～2.0)。

5.实时定量PCR检测 Hes1和Mash1的表达

第一步:对提取的RNA进行逆转录反应,逆转录反应体系 10μl中含:2μg 总 RNA、1mMdNTP、5×M-MLV buffer、10 U RNase Inhibitor、50 μM Oligo(d T)、RTaseM-MLV(RNase H-)50 U。42℃反应1h后,70℃保温15 min冰上冷却,将所得cDNA于-20℃保存备用。

第二步:实时荧光定量 PCR:用ABI公司的引物设计软件 Primer Express设计实时荧光定量PCR的 Hes1、Mash1和18S r RNA引物。以实时荧光定量PCR来检测未干扰及用不同浓度siRNA干扰 Hes1后Mash1表达变化情况,18s为内参照。20μl的反应体系包括:10μl的 2 ×SYBR Green Master Mix(ABI公司的 SYBR Green试剂盒),10μM 的上下游引物各 1μl,1 ul cDNA。在 ABI 7300型定量 PCR仪上以下列条件进行扩增:95℃10 min,95℃15 S,60℃1 min,循环 40次(表 1)。采用比较 CT值法,应用 RQ study软件(Applied Biosystems)进行miRNAS的相对定量分析。

表1 Hes1,Mash1,18Sr RNA基因的引物序列Table 1 Primer sequences of Hes1,Mash1,18Sr RNA for Real-time PCR

6.统计学处理

实验数据用均数 ±标准差(¯x±s)表示,采用SPSS13.0统计分析软件进行单因素方差分析,多组间指标的比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA),LSD检验,P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.分离培养BMSCs的形态学特点

经分离的骨髓细胞悬液培养3d后全量换液,去除未贴壁细胞,可见贴壁生长的细胞大部分呈梭形,呈旋涡状生长,少部分呈多角形,细胞核居中,折光性强。贴壁细胞呈单层生长,生长迅速,细胞呈团簇状,分布不均,显示出集群生长趋势。之后细胞相互间渐紧密贴附,呈条索状汇合。7d左右细胞达到70%以上的汇合。P3以后的细胞形态较为均一(图1)。传代细胞形态呈多角形,随着传代次数增加,细胞突起增多。P3的细胞经免疫荧光鉴定CD71表达阳性(图2)。

2.干扰 Hes1后Mash1的表达变化

实时定量 PCR检测结果显示:Hes1基因和Mash1基因在 BMSCs P3中都有表达,分别用200nM,100nM,50nM,25 nM四组不同浓度的siRNA对 Hes1干扰后,Hes1基因表达均有所下降,200 nM和50 nM浓度组降低最显著,认为以上四组不同浓度的siRNA与对照组相比存在统计学意义(P<0.05)。表明 Hesl基因沉默成功。高浓度(200nM)干扰组的 siRNA对 Hes1表达减弱以及Mash1表达增加的效果优于低浓度(50nM)干扰组,基于以上结果,我们选择200 nM和50 nM浓度组的siRNA用于检测Mash1基因的表达,结果显示Mash1基因表达均有所增高。因此,我们认为经200nM和50nM的siRNA干扰Hes1后检测Mash1基因的表达变化与对照组相比存在统计学意义(P<0.05)。

讨 论

BMSCs是一种具有多分化潜能的干细胞,在体内外特定条件下可以横向诱导分化为神经元和神经胶质细胞[6]。在课题组的前期实验中,我们分析了Hes1基因和Mash1基因在BMSCs中诱导分化为神经元过程中的表达变化情况,得出 Hes1在BMSCs表达较高,Mash1在BMSCs表达较低的结论[7]。Nakamura等的研究表明,Hes1-/-的小鼠过早地表达了早期和晚期的神经元标志,说明 Hes1在维持神经干细胞的增殖方面发挥了重要的作用[8]。Mash1作为 Hes1的下游基因,短暂性地表达于小鼠早期发育的神经系统中,同时还是各器官在胚胎发育过程中一个重要的转录因子。另外,Mash1还能够促使神经前体细胞产生以及促进这些多潜能前体细胞向不同神经元类型分化[9]。因此我们观察了干扰Hes1基因后下游基因Mash1的表达变化情况,以期了解 Hes1和Mash1两者之间的关系。

在Bai等人的实验中曾使用100nM的siRNA干扰Hes1,经 siRNA转染后的神经干细胞 Hes1基因表达显著降低[10]。因此,本实验过程采用四种不同浓度梯度的 Hes1的siRNA干扰抑制BMSCs中 Hes1基因的表达,终浓度分别为 200nM,100nM,50nM,25nM的 siRNA,得出 200nM和50nM干扰效果最好的结论,但考虑到经济成本,我们推荐使用50nM的siRNA。故本实验选定的最适浓度可以成为今后干扰试验的参考浓度。

Hes1和Mash1基因均属于b HL H转录调控因子家族基因,该家族参与了动物体内许多器官的发育过程,并发挥了重要的作用[11-13]。因此在本实验中,我们选用终浓度为200nM和50nM的siRNA干扰组进一步检测Mash1的表达变化,发现干扰Hes1基因的表达,Mash1基因的表达较干扰前增高。课题组前期实验证明,在BMSCs的培养过程中,随着传代次数的增加,Hes1的表达呈现逐渐下降的趋势,而Mash1则逐渐上升,诱导分化后 Hes1较未诱导组降低,Mash1增高[7],与本实验结果中Hes1,Mash1变化趋势相同。据报道,Hes1高表达于神经干细胞中,在胚胎时期 Hes1的缺失可导致胚胎发育缺陷[14]。Mash1在神经元分化及神经元特定亚型选择性分化中发挥中心调控作用[15]。Alexandros等证实,降低 Hes1,Mash1 mRNA的降解率可影响神经细胞分化的进程[16]。实验研究发现,在利用RNAi技术使 Hes1表达下调后,Mash1表达较未干扰组显著上调,由此我们认为 Hes1和Mash1基因在BMSCs的培养过程中可能有重要作用,并且 Hes1对Mash1呈负相关调控关系。

研究中我们通过对BMSCs培养过程中 Hes1基因的人为干扰,运用RNAi技术干扰发育调控基因 Hes1,同时利用实时定量PCR技术检测在BMSCs传代中,Mash1的表达变化情况。实验结果显示:成功地抑制 Hes1基因的表达,Mash1基因的表达较干扰前增高,Hes1和Mash1两者之间呈负调控关系。因此本实验可为了解BMSCs的分化机制提供了一个新的思路,也有助于对定向诱导分化关键因素的筛选与确定。在今后的实验中,我们还可以把干扰作为一种诱导手段应用于BMSCs的诱导分化。

[1]Makino S,Fukuda K,Miyoshi S,et al.Cardiomyocytes can be generated from marrow stromal cells in vitro.J Clin Invest,1999,103(5):697-705

[2]Kopen GC,Prockop DJ,Phinney DG.Marrow stromal cells migrate throughout forebrain and cerebellum,and they differentiate into astrocytes after injection into neonatal mouse brains.Proc Natl Acad Sci U S A,1999,96(19):10711-10716

[3]Johansson CB,Momma S,Clarke DL,et al.Identification of a neural stem cell in the adult mammalian central nervous system.Cell,1999,96(1):25-34

[4]徐如祥.神经干细胞.北京:军事医学出版社,2006:44-51

[5]Kageyama R,Ohtsuka T,Hatakeyama J,et al.Roles of b HL H genes in neural stem cell differentiation.Exp Cell Res,2005,306(2):343-348

[6]Mckay R.Stem cells in the central nervous system.Science,1997,276(5309):66-71

[7]蔚洪恩,王春芳,李鹏飞,等.骨髓基质细胞在传代与诱导分化为神经细胞过程中hes1和mash1基因的表达变化.解剖学杂志.2007,30(5):526-529

[8]Nakamura Y,Sakakibara S,Miyata T,et al. The b HL H gene hes1 as a repressor of the neuronal commitment of CNS stem cells.J Neurosci,2000,20(1):283-293

[9]Hamada M,Yoshikawa H,Ueda Y,et al.Introduction of the MASH1 gene into mouse embryonic stem cells leads to differentiation of motoneuron precursors lacking Nogo receptor expression that can be applicable for transplantation to spinal cord injury. Neurobiol Dis,2006,22(3):509-522

[10]Bai G,Sheng N,Xie Z,et al.Id proteins sustain Hes1 expression to maintain neural stem cells. Cell Research,2008,18:s19

[11]Greenbaum S,Zhuang Y.Regulation of early lymphocyte development by E2A family proteins.Semin Immunol,2002,14(6):405-414

[12]Kageyama R,Ohtsuka T,Hatakeyama J.Roles of b HL H genes in neural stem cell differentiation.Exp Cell Res,2005,306(2):343-348

[13]Chien CT,Hsiao CD,Jan L Y,et al.Neuronal type information encoded in the basic-helix-loop-helix domain of proneural genes.Proc Natl Acad Sci U S A,1996,93(23):13239-13244

[14]Ohtsuka T,Ishibashi M,Gradwohl G,et al.Hes1 and Hes5 as Notch effectors in mammalian neuronal differentiation.EMBO J,1999,18(8):2196-2207

[15]Yamamoto S,Nagao M,Sugimori M,et al.Transcription factor expression and Notch-dependent regulation of neural progenitors in the adult rat spinal cord.J Neurosci 2001,21(24):9814-9823

[16]Alexandros Kiparissides,Michalis Koutinas,Toby Moss,et al.Modelling the Delta1/Notch1 Pathway:In Search of the Mediator(s)of Neural Stem Cell Differentiation.PLo SONE,2011,6(2):e14668

The expression of Mash1 after the inhibition of Hes1 gene in BMSCs

Long Zhijing1,Wang Chunfang1＊,Li Pengfei1,Liu Caiyu1Deng Chunsheng2＊,Hu Zhongli3
(1Department of Biotechnology,Shanxi Medical University,Taiyuan 030001;2The 322nd Hospital of PLA,Datong Shanxi 037006;3Taiyuan Hospital of Traditional Chinese Medicine,Taiyuan 030002,China)

Objective To explore the expression of Mash1 after the inhibition of the Hes1 gene in BMSCs.Methods BMSCs isolated f rom bone marrow were cultured in vitro.The morphologic feature and growth status of BMSCs and differentiated BMSCs were observed by inverted microscopy.The expression of Mash1 was analyzed by real-time quantitative PCR.Results The concentrations of Hes1 siRNA were 200nM,100nM,50nM or 25nM.The expression of Hes1 was decreased in comparison with that of the control group.The level of Hes1 at the concentration of 200nM in interfered BMSCs was 0.036-fold of that in control BMSCs(P<0.05),and the level of Hes1 at 50nM in interfered BMSCs was 0.076-fold of that in control BMSCs(P<0.05),both better than the others.The expression of the Mash1 gene was increased after the inhibition of the Hes1 gene in a dose-dependent manner.Conclusion Hes1 can down-regulate the expression of the Mash1 gene in BMSCs.

Bone marrow stromal cell; Gene expression; Hes1; Mash1; RNAi

R322.812

A

10.3870/zgzzhx.2011.03.011

2010-11-10

2011-04-01

山西省自然科学基金(2009011057-1);中国人民解放军第322医院自然科学基金(2011001)

龙志晶,女(1983年),汉族,硕士研究生。

＊通讯作者(To whom correspondence should be addressed)