气相色谱-质谱法同时检测婴幼儿配方奶粉中的6种雌激素残留

孙汉文，李挥，2，康占省，张敬轩，2，吕运开

（1.河北大学 化学与环境科学学院，河北省分析科学重点实验室，河北 保定 071002；2.河北省食品质量监督检验研究院，河北 石家庄 050051）

气相色谱-质谱法同时检测婴幼儿配方奶粉中的6种雌激素残留

孙汉文1，李挥1，2，康占省1，张敬轩1，2，吕运开1

（1.河北大学 化学与环境科学学院，河北省分析科学重点实验室，河北 保定 071002；2.河北省食品质量监督检验研究院，河北 石家庄 050051）

建立了婴幼儿配方奶粉中6种雌激素残留（己烯雌酚diethylstilbesterol，17α-乙炔基雌二醇17α-ethynylestradiol，17α-雌二醇17α-estradiol，17β-雌二醇17β-estradiol，雌三醇estriol，雌酮estrone）的气相色谱-质谱（GC-MS）的检测方法.样品经酶解后，用乙腈超声提取.提取液蒸发至近干，五氟丙酸酐（PFPA）衍生化后，经HP-5MS弱极性色谱柱分离，在SIM模式下进行定性分析和定量检测.结果表明：在0.1～50ng／mL内，6种药物的校准曲线呈现良好的线性，相关系数（r）大于0.999.17α-乙炔基雌二醇的定量限为0.8μg／kg，其余5种的定量限为0.1μg／kg.6种药物在3.0，5.0，10.0μg／kg质量浓度添加水平下，其平均回收率为60.6%～120.6%；相对标准偏差（RSD）为7.8%～19.6%.该方法已成功应用于婴幼儿配方奶粉中6种雌激素残留的定性定量检测.

气相色谱-质谱；雌激素；奶粉

雌激素是由卵巢分泌的一类类固醇激素，雌二醇、雌三醇、雌酮属于天然雌激素，己烯雌酚、17α-乙炔基雌二醇属于合成雌激素.雌激素通过食物链进入人体后会扰乱体内激素平衡，影响生殖系统、神经系统，诱发乳腺癌、卵巢癌等疾病［1-2］.1996年欧盟明令禁止使用具有促生长作用的激素（Council Directiue 96／22／EC，96／23／EC）.《中华人民共和国农业部公告第235号》也规定了己烯雌酚及其盐为禁用药物.但是食品中微量雌激素残留问题依然存在，为了有效地监督奶粉的质量，开发具有高灵敏、高通量检测雌激素残留的确证分析方法是非常必要的.

目前，关于动物源性食品中雌激素残留的测定方法已有综述报道［3-4］，主要有高效液相色谱法［5-6］、液质联用法（LC-MS）［7-12］和气质联用法（GC-MS）［13-16］.但是，关于牛奶和奶粉中雌激素的文献报道较少［6，11-12，16］.婴幼儿配方奶粉基质成分复杂，激素残留量低，而且部分激素化学结构相似，影响分析准确性，因此需要建立快速、准确的方法来解决婴幼儿配方奶粉中的雌激素检测问题.本工作旨在建立一种GC-MS法快速、灵敏、准确测定婴幼儿配方奶粉中己烯雌酚、17α-乙炔基雌二醇、17α-雌二醇、17β-雌二醇和雌三醇和雌酮的雌激素残留.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Aglient6890N-5973i气质联用仪（美国Agilent公司），配有电离源EI；β-盐酸葡萄糖醛苷酶／芳基硫酸酯酶（Merck公司）；五氟丙酸酐（PFPA，Sigma）；己烯雌酚（DES）、17α-乙炔基雌二醇（EE2）、17α-雌二醇（α-E2）、17β-雌二醇（β-E2）、雌三醇（E3）和雌酮（E1）标准品（纯度均大于98.0%，Sigma公司，结构式见图1）；甲醇、乙腈、石油醚（沸程：30～60℃）为色谱纯；其他试剂均为分析纯.

上述标准品分别用甲醇配制成1.0mg／mL的标准储备溶液，-20℃以下保存.临用前用甲醇逐级稀释得到混合激素的标准工作溶液.

图1 6种雌激素的分子结构式Fig.1 Molecular structures of 6estrogens

1.2 样品前处理

实验先以β-盐酸葡萄糖醛苷酶／芳基硫酸酯酶酶解，使结合态的目标物游离，可降低背景干扰和改善灵敏度.称取5.0g奶粉试样于50mL比色管中，加入10mL醋酸缓冲溶液（0.04mol／L，pH 5.0），加水定容至50mL，漩涡混匀30s后，加入β-盐酸葡萄糖醛苷酶／芳基硫酸酯酶100μL，涡旋混匀，于37℃恒温酶解过夜.酶解后样品离心，取10mL上清液加10mL乙腈混匀，超声提取10min，6 000r／min离心10min，取上清液加入5.0g氯化钠混匀静置，将上层有机相转移至50mL比色管中.另取10mL酶解液重复上述步骤，合并上层有机相，40℃下氮吹至近干.向残渣中加入50μL五氟丙酸酐，漩涡混匀1min，在30℃条件下，恒温衍生30min（每隔7，8min混匀1次）.衍生之后，加2mL石油醚和3mL质量分数为1%的碳酸钾溶液，漩涡震荡1min.静置分层后，将上层有机相转移至10mL具塞离心管中.用2mL石油醚重复提取2次，合并上层有机相，40℃下氮吹至干.残余物用正己烷溶解并定容至500μL，上清液经0.22μm滤膜过滤后，以GCMS法测定.

1.3 气相色谱-质谱条件

色谱条件：HP-5MS毛细管柱（30m ×0.25mm，0.25μm）；以高纯氦气为载气，流速1.0mL／min；进样口温度280℃；程序升温：初始温度为70℃，保持1min，然后以30℃／min的升温速度升至180℃，再以5℃／min升至260℃，并保持2min.进样量：不分流进样1.0μL.

质谱条件：选用EI源，SIM采集；电子轰击能量：70eV；四级杆温度：150℃；离子源温度：230℃；接口温度：280℃；溶剂延迟：7min.6种化合物的监测离子见表1.

表1 6种雌激素类药物的GC-MS优化参数Tab.1 Optimized parameters for analysis of six estrogens using GC-MS

2 结果与讨论

2.1 衍生化条件的优化

雌激素分子中含有18个碳原子，A环为苯环，C-3上为酚羟基，C-17为酮基或连有羟基.酸酐为较强的酰化剂，适用于直接酯化难于反应的酚羟基或空间位阻较大的羟基化合物.常用的酰化剂有三氟乙酸酐（TFA）、五氟丙酸酐（PFPA）和七氟丁酸酐（HFBA），本法选用PFPA作衍生试剂.结果表明，PFPA能使6种雌激素中的所有羟基被定量酰化，并且反应生成的羧酸不会使酯发生水解.考察衍生化试剂PFPA加入量（40，50，60，70μL）、衍生温度（20，30，60℃）和衍生时间 （20，30，50min）对质谱测定衍生物丰度的影响.最终加入50μL衍生化试剂，于30℃恒温衍生30min，各衍生物的丰度值达最大.若增加衍生化试剂加入量和提高衍生温度或时间，并不影响衍生物的丰度值.因此，选用50μL衍生化试剂和30℃恒温衍生30min为佳.

2.2 萃取条件的选择

衍生反应除生成酯外，还有酸性副产物五氟丙酸.在将衍生物进注GC前必须事先除去.此外，尚未反应的PFPA也需除去.考察了不同用量的质量分数为1%的碳酸钾溶液（1，2，3，4mL）对质谱丰度的影响，最终表明，加入2mL，效果较好.选择沸程为30～60℃的石油醚作萃取剂，2mL重复萃取2次，获得了较好的回收率.

2.3 特征离子及其比例的确定

6种雌激素经O-酰化反应后，通过HP-5MS弱极性的色谱柱分离，进入离子源，经击碎后产生分子离子和碎片离子，特征离子列于表1中.以相对丰度比为100的离子作为定量离子，另外选取3个相对丰度比较高的作为定性离子（乙炔基雌二醇除外）.雌激素标液、空白奶粉基质、空白奶粉基质加标的总离子流色谱图见图2-4.可以看出，目标峰和干扰峰以及雌二醇的2种同分异构体均得到有效的分离.

图2 6种雌激素的总离子流色谱Fig.2 TIC Chromatograms of six estrogens

2.4 方法的分析特性

6种雌激素的系列标准混合溶液，40℃下氮吹至近干后按2.2条件衍生，后在相同色谱、质谱条件下进行分析.以雌激素衍生后的定量离子的色谱峰面积（y）对标准溶液浓度（x）绘制校准曲线，求得线性回归方程及相关系数（表2）.由表2可以看出，6种药物在0.1～50ng／mL内呈现良好的线性，其相关系数大于0.999.

按所建立的分析方法确定各化合物的校准曲线线性范围和线性回归方程.以S／N＝10所对应的被测化合物的浓度作为方法的定量限（LOQ），6种药物的定量限为0.1～0.8μg／kg（见表2）.本方法的定量限低于文献报道的液相色谱法［5-6］，液质联用法［7-9］和气质联用法［14-16］.

表2 线性方程、相关系数和定量限Tab.2 Linear equations，correlation coefficient and limits of quantification（LOQ）

2.5 样品分析

在5.0g空白奶粉中分别添加3种水平3.0，5.0，10.0μg／kg的混合标准溶液进行回收率实验.平行测定5次，这6种雌激素的平均回收率为60.6%～120.6% （表3）.其相对标准偏差（RSD）为7.8%～19.6%.

表3 6种雌激素的回收率Tab.3 Recovery of six estrogens

抽取市售的26份婴幼儿配方奶粉按上述方法进行测定.结果表明：17α-雌二醇的含量在0.1～4.49μg／kg；在1个样品中检出有17β-雌二醇，含量为0.17μg／kg；在3个样品中检出有雌三醇，含量均为0.19μg／kg；未检出己烯雌酚、雌酮和炔雌醇.

3 结论

所建立的测定婴幼儿配方奶粉中6种雌激素的气质联用方法，具有高通量、高灵敏和高选择性等特点.采用HP-5MS弱极性的色谱柱，通过优化升温程序实现了雌二醇的2种同分异构体的有效分离.本法能够检测10-5g／kg水平的雌激素，可满足奶粉中雌激素的常规检测和奶粉质量控制.

［1］COLBROM T，VOM SEAL F S，SOTO A M.Developmental effects of endocrine-disrupting chemlcals in wildlife and humans［J］.Environ Health Perspect，1993，101（5）：378-385.

［2］袁丽君，徐庄剑，许祥生.牛奶中的雌激素及其安全性［J］.国际内科学杂志，2007，34（4）：712-714

［3］秦伟，刘桂华.动物源性食品中性激素残留检测方法研究进展［J］.中国预防医学杂志，2010，11（7）：746-749

［4］WANG Shuo，HUANG Wei，FANG Guozhen，et al.Analysis of steroidal estrogen residues in food and environmental samples［J］.Int J Environ Anal Chem，2008，88：1-25.

［5］王帆，胡小钟，王勇，等.快速同时检测大豆异黄酮保健食品中三种雌激素的HPLC法［J］.中国卫生检验杂志，2004，14（4）：410-411.

［6］刘宏程，邹艳红，黎其万，等.高效液相色谱分离牛奶中己烯雌酚、己烷雌酚和双烯雌酚［J］.分析化学，2008，36（2）：245-248.

［7］CHUAN Laixu，XIAO Gangchu，CHI Fangpeng，et al.Development of a faster determination of 10anabolic steroids residues in animal muscle tissues by liquid chromatography tandem mass spectrometry［J］.J Pharm Biomed Anal，2006，41：616-621.

［8］张翠英，李振国，徐金玲.LC-MS测定猪肉中己烯雌酚方法的研究［J］.中国卫生检验杂志，2007，17：786-787.

［9］BLASCO C，VAN POUCKE C，VAN PETEGHEM C.Analysis of meat samples for anabolic steroids residues by liquid chromatography／tandem mass spectrometry［J］.J Chromatogr A，2007，1154：230-239.

［10］MALONE E M，ELLIOTT C T，KENNEDY D G，et al.Development of a rapid method for the analysis of synthetic growth promoters in bovine muscle using liquid chromatography tandem mass spectrometry［J］Anal Chim Acta，2009，637（5）：112-120.

［11］YANG Yi，SHAO Bing，ZHANG Jing，et al.Determination of the residues of 50anabolic hormones in muscle，milk and liver by very-high-pressure liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry［J］.J Chromatogr B，2009，877（5-6）：489-496

［12］祝伟霞，刘亚风，杨冀州，等.液相色谱-串联质谱法快速测定婴幼儿配方奶粉中39种激素残留量［J］.Chin J Chromatorgr，2010，28（11）：1031-1037.

［13］丁雅韵，徐晓云，谢盂峡，等.动物组织中己烯雌酚残留的基体固相扩散-气相色谱-质谱分析方法研究［J］.分析化学，2003，31（11）：1356-1359.

［14］FUH M R，HUANG S Y，LIN TY.Determination of residual anabolic steroid in meat by gas chromatography-ion trapmass spectrometer［J］.Talanta，2004，64（2）：408-414.

［15］ZENG Dongping，LIN Cuiping，ZENG Zhenling，et al.Multi-residue Determination of eight anabolic steroids by GC-MS in muscle tissues from pigs［J］.Agricultural Sciences in China，2010，9：306-312.

［16］张宏，王淑惠，杨立学，等.气相色谱-质谱法测定奶粉中的环境雌激素［J］.现代预防医学，2010，37（4）：636-640.

Effective Separation and Simultaneous Determination of Six Estrogen Residues in Infant Formula by GC-MS

SUN Han-wen1，LI Hui1，2，KANG Zhan-sheng1，ZHANG Jing-xuan1，2，LÜYun-kai1
（1.Key Laboratory of Analytical Science of Hebei Province，College of Chemistry and Environmental Science，Hebei University，Baoding 071002，China；2.Hebei Institute of Food Quality Supervision Inspection and Research，Shijiazhuang 050051，China）

New method had been developed for effective separation and simultaneous determination of six estrogen residues including diethylstilbesterol，17α-ethynylestradiol，17α-estradiol hemihydrate，17βestradiol hemihydrate，estriol and estrone in infant formula by gas chromatography-mass spectrometry（GC-MS）.The infant formula samples were enzymatically digested withβ-glucuronidase／arylsulfatase，and then extracted with acetonitrile by ultrasonication.This process was repeated two times and the extracts were combined.The combined extracts were evaporated to dryness.The estrogens in the residue were derivated with pentafluoropropionic anhydride.Six estrogen residues were measured with GC-MS usingelectron impact ionization source in SIM mode.Gas chromatographic separation was performed on a HP-5MS capillary column（30m ×0.25mm internal diameter；0.25μm film thickness）.The baseline separation of two isomers（17α-estradiol hemihydrate and 17β-estradiol hemihydrate）of estradiol was achieved by optimizing the heating process.The calibration curves showed good linearity with correlation coefficient（r）of＞0.999.The limits of quantification（LOQ）of six estrogens ranged from 0.1to 0.8μg／kg.Experiments on spiked infant formula samples showed that at spiked level of 3.0，5.0and 10.0μg／kg，the mean recoveries were within 60.6%-120.6%，and the relative standard deviations ranged from 7.8%to 19.6%.This method had been successfully used for the qualitatively and quantitatively determination of the six estrogen residues in infant formula.

gas chromatography-mass spectrometry；estrogens；infant formula

O 657.7

A

1000-1565（2011）06-0607-05

2011-05-10

河北省自然科学基金资助项目（B2008000583）；河北省科技支撑项目（09227134D，10967126D）

孙汉文（1945-），男，河北魏县人.河北大学教授，博士生导师，主要从事分离科学与药物分析研究.

E-mail：hanwen＠hbu.edu.cn

梁俊红）