液相-质谱联用法检测食品中己烯雌酚的研究

彭婷婷 徐晓萍 朱晓蕾 董 耀

(江苏省生产力促进中心，江苏 南京 210042)

己烯雌酚为人工合成的非甾体类雌激素物质，能产生与天然雌二醇相同的所有药理与治疗作用[1-5]，主要添加在饲料中,能引起人体内激素失调等疾病。研究发现,其在动物性产品中的残留对人体健康和生态环境都会造成严重危害[6]。

雌酚在上世纪七八十年代作为类雌激素药物广泛用于口服避孕以及防止流产。它可以促使女性性器官及副性征正常发育，使子宫内膜增生以及阴道上皮角化，减轻妇女更年期或妇科手术后因性腺功能不足而产生的内分泌功能紊乱，增强子宫收缩，提高子宫对催产素的敏感性。己烯雌酚刚一问世就受到广泛欢迎。许许多多的人不用再担心孩子的出生，以及孩子的无法出生。然而，当时人们完全没有认识到它的危害性，直至大量使用己烯雌酚的女性的孩子出生之后，问题来了，并且在孩子青春期之后更加集中表现出来。服用过己烯雌酚的人生下的女孩，其阴道和宫颈细胞都有不同程度的病变。研究表明，阴道透明细胞腺癌近几年在少女和年轻妇女中的发病率有增加趋势。据调查，这些病人在出生前就受到过己烯雌酚的影响。胎儿期接触过己烯雌酚的妇女，24岁时患本病的累积危险性是0.14%～1.4%。还有相当多的人有子宫颈和阴道的良性组织改变，称为腺瘤病。通过对胎儿期接触过己烯雌酚妇女的常规检查发现，约有1/3的人有上述异常。

在胎儿期接触过己烯雌酚的男性中，生殖系统异常的发生率也很高。这些病人与相同年龄组、在胎儿期未接触过已烯雌酚的人相比，睾丸异常的发生率有显著增加。这些病例，我们称之为“DES综合症”。同时，怀孕期间服用己烯雌酚还可造成胎儿畸形，使女性男性化、男性女性化，甚至引起脑积水、脑脊膜膨出等。同时，对孕妇还可能造成肝脏和肾脏的损害，使哮喘的发病率明显上升，还可能促使胆汁中的胆固醇饱和而形成结石，诱发胰腺炎和血管栓塞性疾病。这时人们才发现，己烯雌酚是一种环境激素，与雌激素受体结合后会干扰人的内分泌，诱发生殖器病变与肿瘤。

1 实验部分

1.1 主要试剂

标准物质样品:己烯雌酚(中国计量科学研究院)。

标准溶液:水；甲酸；甲醇(色谱纯，Fisher scientific)。

1.2 主要仪器

LC-MS(CLARUS SQ 8，PekinElmer)。

1.3 样品处理

将样品制成均匀的颗粒，称取2.0 g，精确至0.1 mg，置于50 mL带磨口塞子的试管中，加入萃取剂甲醇。放入40 ℃超声水浴仪中超声萃取，萃取液经离心，过滤，定容至10 mL，过膜，作为待测样。

1.4 仪器分析条件

色谱柱：ELITE-5HT,15 cm×0.25 mm×0.10 μm；进样口温度35 ℃；载气：氮气，流量：1.2 mL/min；进样量：10 μL；电离源：ESI；流动相：0.1%甲酸/乙腈=40/60；己烯雌酚母离子269.2，子离子135.2和107.2，碰撞能量分别为10 V和20 V。

2 结果与讨论

2.1 超声波萃取条件的优化

本文将标准物质己烯雌酚作为研究对象，在超声波萃取中，通过分析该标准样品，对萃取时间和溶剂量进行优化。

2.1.1 最佳萃取时间的选择

为了得到样品最佳萃取时间，选用甲醇作为萃取溶剂，溶剂量为10 mL，依次设定萃取时间7.5 min、15 min、30 min、45 min、60 min、90 min，结果见图1。可知，样品在萃取30 min之后，己烯雌酚的萃取率大于99%,且稳定，因此其最佳萃取时间为30 min。

图1 超声波萃取时间与萃取率的关系图Fig.1 Relationship between extraction time and sample extraction rate

2.1.2 最佳溶剂量的选择

溶剂量也是影响超声波萃取效果的主要因素，根据2.1.1的结果，超声萃取时间30 min，甲醇的用量为5 mL、10 mL、15 mL、20 mL、25 mL，实验结果如图2。由图可得，其最佳溶剂量为10～15 mL。

图2 超声波萃取溶剂量与萃取率的关系图Fig.2 Relationship between extraction solvent content and sample extraction rate

2.2 方法的线性方程及相关系数

配制浓度为20,50,80，100,150,200 ng/mL的一系列己烯雌酚的标准溶液，在前述的仪器分析条件下进行标准曲线的绘制。如图3所示，采用液质联用的方法，其线性相关系数为0.999，可知标准工作曲线具有良好的线性。

图3 己烯雌酚线性图谱Fig.3 The linear graph of stilbestrol in LC-MS

2.3 实际样品的检测

2.3.1 回收率实验

采用上述优化的参数条件对自备实际样品进行前处理，最后对所得样品进行LC-MS检测，平行测定5次。采用标准加入法来考察本方法的准确性，如表1所示，回收率在96.0%～104.0%之间,RSD在2.10%～5.86%。

表1 样品回收率Tab.1 sample recoveries

2.3.2 对照实验

为了进一步验证超声波萃取/液相色谱质联用仪分析方法的可行性，同时还采用了液相色谱法对上述实际样品进行检测，所测得结果平均值相近，RSD在1.0%～1.7%之间。结果如图4、图5和表2所示。

图4 液相色谱法己烯雌酚色谱图Fig.4 The chromatogram of stilbestrol in HPLC

图5 液相色谱法己烯雌酚的线性图Fig.5 The linear graph of stilbestrol in HPLC

表2 参照实验Tab.2 controlled experiment.

3 结论

本文以超声波萃取技术对动物源性食品进行样品处理，采用液相色谱—质谱法对己烯雌酚的含量进行测定。该方法简便，高效，重复性好，回收率高。并和液相色谱法进行对照实验比较，证明了该方法的可行性。