聚色氨酸修饰玻碳电极测定动物性食品中己烯雌酚

马心英,吕惠萍,王宜磊(.菏泽学院化学化工系,山东菏泽 27405; 2.菏泽学院生命科学系,山东菏泽 27405)



聚色氨酸修饰玻碳电极测定动物性食品中己烯雌酚

马心英1,吕惠萍1,王宜磊2,*
(1.菏泽学院化学化工系,山东菏泽 274015; 2.菏泽学院生命科学系,山东菏泽 274015)

用循环伏安法制备了聚色氨酸修饰玻碳电极。研究了己烯雌酚在聚色氨酸修饰电极上的电化学行为，建立了一种直接测定动物性食品中己烯雌酚含量的新方法。实验结果表明:在pH=5.0的磷酸盐缓冲溶液体系中,己烯雌酚在聚色氨酸修饰玻碳电极上于-0.2～0.8 V范围内出现一对可逆的氧化还原峰,与裸玻碳电极相比较,聚色氨酸修饰电极对己烯雌酚的电化学反应具有促进作用。己烯雌酚浓度在5.00×10-8～1.00×10-6mol/L范围内与其氧化峰电流成正比,检出限为2.00×10-9mol/L,对己烯雌酚溶液平行测定6次的RSD为2.4%。该修饰电极具有良好的灵敏度、选择性和稳定性,可用于牛肉、鱼肉及奶粉中己烯雌酚含量的测定,回收率为96.0%～102.3%,结果满意,方法具有实用价值。

聚色氨酸,修饰电极,循环伏安法,己烯雌酚

己烯雌酚(DES)是人工合成的非甾体雌激素物质,主要用于治疗激素平衡失调引起的功能性出血、闭经雌激素缺乏症等,由于其价格便宜,疗效明显,20世纪40至60年代在医学临床上广泛应用。此外DES具有降低脂肪合成、加快蛋白质代谢合成和增加动物体重等作用,因此被作为促生长剂在畜牧养殖业广泛应用[1-2]。但后来研究发现,由于DES的使用,可能导致其在生物体内残留,影响细胞内钙离子水平和生殖能力[3],并存在诱发癌症危险,可导致白血病、子宫癌等疾病[4],增加女性乳腺癌、阴道腺癌发病率[5]。从20世纪70年代末,中国、美国、欧盟等国家,先后禁止DES在食品动物中使用。然而,由于能给食品动物养殖业带来经济利益,己烯雌酚的滥用现象仍然存在。因此,建立准确、灵敏、简便的测定己烯雌酚的分析方法非常必要。国内报道用于检测DES的方法主要有高效液相色谱法[6-8]、免疫检测法[9-11]、气相色谱-质谱联用法[12-14],而电化学法报道较少[3,15]。

本实验研究了聚色氨酸修饰电极的制备及己烯雌酚在修饰电极上的电化学行为,己烯雌酚分子中的酚羟基具有电化学活性,可在聚色氨酸电极上发生电化学氧化还原反应,而在同样条件下,己烯雌酚在裸玻碳电极上的电化学活性却低得多,因此建立了测定己烯雌酚的电化学新方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

色氨酸 分析纯,国药集团化学试剂有限公司,用二次蒸馏水配制成1.00×10-3mol/L溶液;己烯雌酚 标准品,成都艾科达化学试剂有限公司,用乙醇配制1.00×10-3mol/L标准溶液;磷酸氢二钠 分析纯,上海试剂二厂,用二次蒸馏水配制成0.20 mol/L溶液;柠檬酸 分析纯,上海谱振生物科技有限公司,用二次蒸馏水配制成0.10 mol/L溶液;磷酸盐缓冲溶液体系(PBS,pH为2.2～8.0) 由磷酸氢二钠溶液和柠檬酸溶液按一定比例配制;鲫鱼 购自某农贸市场;牛肉 购自某农贸市场;奶粉 购自某超市；其他试剂 分析纯；实验用水 二次石英重蒸水。

CHI660E型电化学分析系统 上海辰华公司;KQ-100型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;ESJ180-4电子分析天平 成都市宜邦科析仪器有限公司;Sirion 200电子扫描显微镜 美国FEI公司;KH-100DB型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;SYZ-550型石英亚沸高纯水蒸馏器 江苏金坛有限公司;电化学实验用三电极系统 上海仙仁有限公司;玻碳电极 上海辰华公司;Ag/AgCl电极 上海辰华公司;铂丝电极 上海辰华公司。

1.2 实验方法

1.2.1 修饰电极最佳聚合条件优化方法 将玻碳电极(Φ=3.8 mm)用二次蒸馏水冲洗后在金相砂纸上打磨,接着用三氧化二铝粉在麂皮上抛光成镜面,再次用二次水冲洗;然后分别在硝酸∶蒸馏水(1∶1)、无水乙醇、二次蒸馏水中各超声1 min。以预处理好的玻碳电极为工作电极,Ag/AgCl电极为参比电极,铂电极为对电极,在3.00×10-4mol/L色氨酸溶液中,对制备修饰电极的聚合底液pH、聚合电位、扫描速度、聚合周数进行优化。

聚合底液pH的选择:固定电位范围为-1.6～2.2 V,扫描速度为80 mV/s,聚合周数为6,改变聚合底液pH分别为2.2、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0进行电化学聚合,利用所制备的修饰电极测定1.00×10-6mol/L己烯雌酚溶液,当所测得的氧化峰电流最大时,所对应的聚合底液的pH7.0即为最佳聚合pH。

聚合电位:固定聚合底液pH为7.0,扫描速度为80 mV/s,聚合周数为6周,低电位为-1.4 V,分别改变高电位为1.8、2.0、2.2、2.4、2.6 V进行实验,利用所制备的修饰电极测定己烯雌酚溶液,当所测得的氧化峰电流最大时,所对应的电位即为最佳高电位;按同样的方法固定聚合高电位为2.4 V,改变低电位分别为-1.2、-1.4、-1.6、-1.8、-2.0 V进行实验,当所测得的氧化峰电流最大时,测得聚合低电位为最佳。

聚合扫描速度:固定聚合底液pH为7.0,聚合周数为6周,电位范围为-1.6～2.4 V,分别改变扫描速度为20、40、60、80、100、120、140 mV/s进行实验,当所测得的氧化峰电流最大时,测得聚合扫描速度为最佳。

聚合周数:固定聚合底液pH为7.0,电位范围为-1.6～2.4 V,扫描速度为100 mV/s,分别改变扫描周数为2、4、6、8、10、12进行实验,当所测得的氧化峰电流最大时,测得聚合周数为最佳。

1.2.2 修饰电极的制备 将预处理好的玻碳电极浸入色氨酸的PBS(pH=7.0)中,采用三电极体系,在-1.6～2.4 V电位范围内以100 mV/s的扫速循环扫描,循环8周后取出,用二次水淋洗,即制得聚色氨酸修饰电极,在室温下保存。

1.2.3 己烯雌酚最佳测定条件优化方法 用修饰电极为工作电极,Ag/AgCl电极为参比电极,铂电极为对电极,对己烯雌酚测定的pH、高低电位、扫描速度和搅拌富集时间进行优化,当所测得己烯雌酚氧化峰电流最大时所对应的条件,即为最佳条件。

测定底液pH实验条件:在1.00×10-6mol/L己烯雌酚溶液中,固定电位范围为-0.2～0.8 V,扫描速度为100 mV/s,搅拌富集时间60 s,改变溶液的pH分别为2.2、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0进行实验。

测定高低电位范围条件:在pH5.0 PBS中,己烯雌酚浓度为1.00×10-6mol/L,扫描速度为100 mV/s,搅拌富集时间40 s,固定低电位为-0.1 V,改变高电位分别为0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1 V进行实验,当所测己烯雌酚氧化峰电流最大时,所对应的电位即为高电位;固定高电位为0.8 V,改变低电位分别为-0.4、-0.3、-0.2、-0.1、0.0、0.1、0.2 V进行实验,当己烯雌酚氧化峰电流最大时,对应电位即为最佳低电位。

测定扫描速度条件:在1.00×10-6mol/L己烯雌酚pH5.0 PBS中,固定电位范围为-0.2～0.8 V,搅拌富集时间40 s,改变扫描速度从20 mV/s开始,每隔20 mV/s进行实验,直至400 mV/s,选择峰形较好、检测灵敏度较高的扫描速度。

搅拌富集时间条件:在1.00×10-6mol/L己烯雌酚pH5.0 PBS中,固定电位范围为-0.2～0.8 V,扫描速度为100 mV/s,改变搅拌富集时间分别为10、20、30、40、50、60、70、80、90 s进行实验。

根据扫描速度实验结果及描述准可逆薄层电化学的Laviron理论[16]，计算电子转移数nα及电子传递系数α。

Epa=a+(2.303RT/(1-α)nαF)lgv

式(1)

Epc=b-(2.303RT/αnαF)lgv

式(2)

式中,a、b为常数。

1.2.4 己烯雌酚测定方法 在电解池中加入一定量己烯雌酚、pH5.0 PBS,以修饰电极为工作电极,Ag/AgCl电极为参比电极,铂电极为对电极,搅拌60 s,在-0.2～0.8 V电位范围内,以100 mV·s-1扫描速度进行循环扫描,记录峰电位和峰电流。每次扫描结束后,将电极置于空白底液中循环扫描至峰消失,用二次蒸馏水冲洗,滤纸吸干后,即可进行下一次测定。实验所得循环伏安曲线研究己烯雌酚在修饰电极上的电化学行为。

1.2.5 样品处理方法 牛肉样品前处理:取一定量新鲜牛肉用绞肉机搅碎,然后称取4份牛肉各5.000 g分别于4支样品管中,分别标号1、2、3、4,然后分别向1样品管中加入3 mL乙腈-丙酮(4∶1)混合溶液,2、3、4样品管中分别加入7.5、12.5、15 μL己烯雌酚标准溶液和3 mL乙腈-丙酮混合溶液(4∶1),将各样品管置于超声清洗器超声分散30 min，再用离心机于2000 r/min下离心10 min,取上清液移至A、B、C、D四个小烧杯中;再分别向4支样品管中加入3 mL乙腈-丙酮(4∶1)混合溶液,按照同样的方法处理,分别合并上清液。将烧杯内所合并的上清液吹干后,分别加入4 mL pH=5.0的磷酸盐缓冲溶液和1 mL乙醇,溶解浓缩物后用于实验测定。

鱼肉样品前处理:取5条新鲜鲫鱼,去鳞后用绞肉机搅碎,称取4份鱼肉各5.000 g于1、2、3、4样品管中,与牛肉处理方法相同。

奶粉样品前处理:称取4份奶粉各0.3000 g于1、2、3、4样品管中,其他步骤与牛肉处理方法相同。

2 结果与讨论

2.1 最佳聚合条件

通过实验优化了制备聚色氨酸修饰电极的最佳聚合条件。实验结果表明,聚合底液的pH、聚合电位、扫描速度、聚合圈数会对修饰电极的性能有一定的影响,当聚合底液pH7.0、色氨酸浓度为3.00×10-4mol/L、聚合的电位范围为-1.6～2.4 V,扫描速度为160 mV·s-1,聚合圈数为8周时,所制备的修饰电极对己烯雌酚的电催化效果最好,己烯雌酚在修饰电极上的响应电流最大。

随着实践进程的推进，大学生自行寻找解决问题的途径和方法就变得异常重要。作为导师，要根据自己的实践经历和人生经验，特别是通过自己的学习和积累，及时、准确、高效地引导低年级学生及时提升实践项目所需的实战型技能，强化自学能力，以便不断解决实践过程中存在的问题。

2.2 色氨酸修饰电极的聚合循环伏安曲线

在最佳聚合条件下得到的色氨酸在玻碳电极上聚合循环伏安曲线(图1),在扫描的第一周,在-0.50 V和1.75 V处分别出现一还原峰和氧化峰,随着扫描周数的增加,氧化还原峰电位均发生负移,峰电流逐渐增大,但增加的幅度逐渐减小,表明色氨酸在电极表面发生了聚合反应。聚合结束后可观察到玻碳电极表面有一层深蓝色膜存在。图2(B)为聚色氨酸修饰电极扫描电镜图,与裸电极(图2A)相比,可观察到电极表面形成了具有立体空间结构层状修饰物。

图1 色氨酸在玻碳电极上聚合循环伏安曲线Fig.1 Cyclic voltammograms for electropolymerization of tryptophana

图2 玻碳电极(A)与聚色氨酸修饰电极扫描电镜图(B)Fig.2 SEM image of the GCE(A) and the poly tryptophan film on the GCE(B)注:放大倍数为100000倍。

2.3 己烯雌酚在聚色氨酸修饰电极上的电化学行为

图3分别是最佳实验条件下己烯雌酚在裸电极、聚色氨酸修饰电极上以及聚色氨酸修饰电极在pH=5.0 PBS中的循环伏安曲线,由图3可见己烯雌酚在裸电极上电流响应微弱,而在聚色氨酸修饰电极上的氧化还原峰电流值分别为ipa=15.44 μA,ipc=7.63 μA,与裸电极相比,己烯雌酚在聚色氨酸修饰电极上氧化峰电流显著增高,明显提高了测定的灵敏度。说明聚色氨酸修饰膜对己烯雌酚电化学氧化具有很好的催化作用。己烯雌酚在聚色氨酸修饰电极上的氧化还原峰电位分别为Epa=0.38 V,Epc=0.13 V,ipa/ipc>1,ΔE=0.25 V,故此反应为半可逆反应。图3表明聚色氨酸修饰电极在pH=5.0 PBS中没有测到氧化还原峰电流,说明测定底液对实验无干扰。

图3 1.0×10-6 mol/L己烯雌酚循环伏安曲线Fig.3 Cyclic voltammograms of 1.0×10-6 mol/L diethylstilbestrol注:1为玻碳电极,2为聚色氨酸修饰电极, 3为聚色氨酸修饰电极在磷酸盐缓冲溶液 (pH=5.0)中,扫描速度:100 mV/s。

2.4 最佳测定条件

图4 1.0×10-6 mol/L 己烯雌酚在不同pH磷酸盐缓冲溶液中在聚色氨酸修饰电极上的循环伏安曲线Fig.4 Cyclic voltammograms of 1.0×10-6 mol/L diethylstilbestrol at different pH values on the PTRY/GCE注:a～g分别对应pH2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和 8.0,扫描速度:100 mV/s。

2.4.2 测定高低电位的影响 己烯雌酚在修饰电极上氧化峰电流的大小与实验所确定的最高和最低电位有一定的关系,固定低电位为-0.4 V,改变高电位进行实验。结果表明,当高电位为0.8 V时,己烯雌酚在修饰电极上的响应电流最大,因此本实验的测定最佳高电位为0.8 V。

保持其它条件一致,同样固定高电位0.8 V,改变低电位进行实验。结果表明,当低电位为-0.2 V时,己烯雌酚在修饰电极上的响应电流最大,因此本实验的测定最佳低电位为-0.2 V。

综上所述,本实验测定的最佳电位范围为-0.2～0.8 V。

2.4.3 测定扫描速度的影响 改变扫描速度进行实验,结果表明:己烯雌酚在修饰电极上氧化还原峰电流与扫描速度呈良好的线性关系(图5内插图),其线性回归方程分别为:ipa=-3.59×10-6-2.31×10-7v(mV/s),r=-0.9997;ipc=1.79×10-5+1.61×10-7v(mV/s),r=0.9953。说明己烯雌酚在聚色氨酸修饰电极上的电极过程为吸附控制过程。随着扫描速度的增加,峰电流也跟着增大(图5)。扫速过低,氧化峰不明显,扫速过高,会降低检测的灵敏度,因此本实验选用的测定最佳扫描速度为100 mV/s。

图5 1.00×10-6 mol/L己烯雌酚在聚色氨酸修饰电极上随扫描速度变化的循环伏安曲线Fig.5 Cyclic voltammograms of 1.00×10-6 mol/L diethylstilbestrol at PTRY/GCE with the change of scanning speed注:pH=5.0,a～j对应的扫描速度(mV/s):40,80,120,160,200,240,280,320,360,400;内插图为己烯雌酚氧化还原峰电流与扫描速度关系曲线,1为还原峰,2为氧化峰。

图6为己烯雌酚在聚色氨酸修饰电极上的氧化还原峰电位随lgv变化的关系曲线。根据描述准可逆薄层电化学的Laviron理论,扫描速度在160～400 mV/s的区间内时,Epa=-0.14+0.19lg v,r=0.9938,Epc=0.48-0.18lg v,r=-0.9942。根据式(1)、式(2)得出电子转移数nα=0.64,电子传递系数α=0.51,接近于理论值0.5,符合准可逆过程特征。

图6 己烯雌酚在聚色氨酸修饰电极上的氧化还原峰电位随lgv变化的关系曲线Fig.6 Plot of 1.00×10-6 mol/L diethylstilbestrol peak potentials versus the logarithms of the scan rates

2.4.4 最佳搅拌时间的选择 测定峰电流的大小与实验过程中搅拌时间也有一定的关系。结果表明,当待测液的搅拌时间为60 s时峰电流达到最大(图7)。因此,本实验进行过程中,待测液的最佳搅拌时间为60 s。

图7 己烯雌酚在聚色氨酸修饰电极上的氧化峰电流随搅拌时间变化的关系曲线Fig.7 Plot of 1.00×10-6 mol/L diethylstilbestrol oxidation peak currents versus the stiring time

图8 不同浓度的己烯雌酚在聚色氨酸修饰电极上的循环伏安曲线Fig.8 Cyclic voltammograms of diethylstilbestrol at PTRY/GCE at different concentrations注:曲线a～f分别对应于浓度5.00×10-8、1.00×10-7、2.50×10-7、5.00×10-7、7.50×10-7和1.00×10-6 mol/L。内插图为己烯雌酚氧化峰电流与其浓度关系曲线。

2.5 工作曲线与重现性

在最佳实验条件下,用循环伏安法对己烯雌酚溶液进行测定。己烯雌酚在5.00×10-8～1.00×10-6mol/L浓度范围内与其氧化峰电流呈良好的线性关系(图8),线性方程为ipa=6.78×10-7+4.96c (mol/L),相关系数r为0.9987。逐渐降低己烯雌酚浓度,当浓度在小于2.00×10-9mol/L时氧化峰消失,由此得出检出限为2.00×10-9mol/L。

在最佳聚合条件下,对浓度为1.00×10-6mol/L的己烯雌酚进行平行测定,重复6次,得到的相对标准偏差为2.4%。

2.6 干扰实验

2.7 回收率的测定

在最佳实验条件下,对牛肉、鱼肉和奶粉样品进行回收率测定。测定结果见表1，回收率在96.0%～102.3%之间,并且用高效液相色谱法进行了方法对比,色谱条件见文献[7]。与色谱法测定结果接近一致,说明实验方法的可靠性与准确性,结果满意。

表1 食品样品中己烯雌酚回收率测定结果(n=6)Table 1 Recovery measurements of the DES in food samples(n=6)

注:a本方法测定结果;b高效液相色谱法测定结果。

3 结论

通过优化实验条件,制备了聚色氨酸修饰电极,实验结果表明,修饰电极对己烯雌酚具有较好的电催化作用,可用于动物性食品中己烯雌酚的电化学测定。在5.00×10-8～1.00×10-6mol/L范围内,己烯雌酚氧化峰电流与其浓度呈线性关系,检出限为2.00×10-9mol/L,相关系数r=0.9987,RSD=2.4%。聚色氨酸修饰电极可以实现对牛肉、鱼肉、奶粉样品中的己烯雌酚检测,回收率为96.0%～102.3%,克服了多巴胺、抗坏血酸、尿酸、维生素E、雌二醇、雌三醇、雌酮、叶酸等的干扰,因此方法灵敏、准确、简单、快速,且选择性较高,具有实用价值。

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Determination of diethylstilbestrol in animal food by a poly(tryptophan)modified glassy carbon electrode

MA Xin-ying1,LV Hui-ping1,WANG Yi-lei2,*

(1.Department of Chemistry and Chemical Engineering,Heze University,Heze 274015,China; 2.Department of Life Science,Heze University,Heze 274015,China)

A poly(tryptophan)modified glassy carbon electrode(PTRY/GCE)was prepared by cyclic voltammetry. The electrochemical behavior of diethylstilbestrol(DES)at the fabricated electrode was studied. A new method for the determination of DES in animal food was established. The experimental results showed that in pH5.0 phosphate buffer solution(PBS)system,DES appeared a pair of quasi redox peaks in the potential range of-0.2 to 0.8 V on the PTRY/GCE. The modified electrode showed a catalytic effect to the electrochemical reaction of DES. The oxidation peak current was proportional the concentratio of DES with a linear range of 5.00×10-8to 1.00×10-6mol/L and a limit of detection was 2.00×10-9mol/L. The RSD for 6 paralled determinations was 2.4%. The poly(tryptophan)modified glassy carbon electrode had good sensitivity,selectivity,and stability. The method could be applied to the determination of DES in beef,fish and milk powder with recoveries of 96.0%～102.3%. The results were satisfactory,and the method had practical value.

poly tryptophan;modified electrode;cyclic voltammetry;diethylstilbestrol

2016-11-23

马心英(1971-),女,硕士,副教授,研究方向:电分析化学,E-mail:dhx3699@163.com。

*通讯作者:王宜磊(1964-),男,本科,教授,研究方向:微生物代谢与发酵,E-mail:wangyilei001@163.com。

山东省自然科学基金(ZR2014BL020);山东省高校科技计划项目(J14LC55);菏泽学院海外智力为国服务行动计划。

TS207.3

A

1002-0306(2017)14-0011-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.14.003