对氧磷酶-1在糖尿病眼部并发症中的作用研究进展△

禹倩倩 综述 姚 勇 审校

对氧磷酶(paraoxonase，PON)是一类能催化水解磷酸酯键的芳香酯酶。该酶可降解有机磷酸酯、芳香羧酸酯及氨基甲酸酯等，更为重要的是还可以减少过量过氧化物、氧化型磷脂的生成。目前研究发现，PON的活性改变与有机磷中毒、心脑血管疾病、糖尿病及其并发症均有关。随着人口老龄化的加快和人民生活水平的提高，糖尿病及其并发症发生率逐步上升，使得PON与糖尿病及其并发症的关系成为一个新的研究热点。目前糖尿病视网膜病变和糖尿病性白内障的发生靠单纯的血糖控制并不能达到较好的预防和控制的目的，因此超越以葡萄糖为中心的糖尿病防治新策略已逐渐受到重视。研究糖尿病患者PON-1活性的变化与糖尿病视网膜病变和糖尿病性白内障的关系以探讨其相关的危险因素，可为糖尿病眼部并发症的防治提供新思路。

1 PON的生物学特性

1.1 PON家族 1964年，首次报道了在动物组织内存在一种能水解有机磷酸盐的酶［1］。这种酶的发现使得人类开始了对血浆PON-1的鉴定，该酶可水解杀虫剂对硫磷的毒性代谢产物。

人类PON基因家族包括3个成员:PON-1、PON-2和PON-3，它们相互紧靠着在7q21.3～22.1染色体的长臂上。人类PON-1和PON-2主要在肝脏合成并被分泌到血液中，均能在血液中与高密度脂蛋白相结合，但是PON-1几乎独占了高密度脂蛋白。大部分PON-3在肝脏内表达，在肾脏内低水平表达。在鼠类的巨噬细胞中已检测到PON-3的mRNA和蛋白，但在人巨噬细胞中不存在［2］。PON家族的3个成员的mRNA在胃肠道都有表达，然而在蛋白水平仅有PON-2表达［3］。PON-2几乎表达在所有组织，但在血浆中却没有发现，可能的原因是存在复杂的mRNA形式。根据系统发育分析论，发现PON-2是该酶家族中最老的成员［4］。

1.2 PON的功能 PON-1能可逆地结合并水解有机磷酸盐，是神经系统免受进入循环的有机磷酸盐毒害的主要途径，而且酯酶活性和内酯酶活性可阻止低密度脂蛋白的氧化和水解同型半胱氨酸硫代内酯。体外测定表明，PON-1和PON-3能够抑制低密度脂蛋白的脂质氧化，动脉粥样硬化的启动和进展与氧化脂质水平的降低有关［5］。

PON-1能抑制巨噬细胞内胆固醇的生物合成和刺激巨噬细胞内胆固醇的外流［6-8］，还可以代谢胆固醇酯等过氧化物类物质。PON的抗动脉粥样硬化的作用活性与在高密度脂蛋白微粒上的定位密切相关。高密度脂蛋白有2个关键点:一个是胆固醇流出的调节，还有一个是低密度脂蛋白脂质氧化的限制［9］。在高密度脂蛋白的保护功能中PON起了一个中枢的作用［8，10］。PON-1在高密度脂蛋白的糖化易感性中也有调节性作用［11］。低密度脂蛋白第283位上的半胱氨酸在低密度脂蛋白的抗氧化作用中是必不可少的，但是这个半胱氨酸与有机磷酸盐的水解无关。可以说明，PON可能有2个不同的催化位点，2种功能被不同的构象激活。近年的研究表明，PON可以水解酰基丝氨酸内酯类物质，该分子调节细菌的信号转导，这一信号对调节毒性因子的表达和诱导宿主的炎症反应是非常重要的［12］。

1.3 PON的基因多态性 PON基因启动子区存在多个基因多态性，会影响酶的表达和血浆酶的浓度。107 C＞T的基因多态性是PON-1浓度最重要的决定基因［13］。PON-1基因的编码区包括2个多态位点:在第55位上亮氨酸和甲硫氨酸的转换(55 L＞M);第192位上谷氨酰胺和精氨酸的转换(192 Q＞R)。由于PON-1启动子区基因多态性的连锁，55 L＞M的基因多态性会影响PON-1的活性。另外，55 L＞M多态性定位在 PON-1的 N末端，在PON-1和高密度脂蛋白的结合中起了重要的作用。192 Q＞R多态性在酶的水解活性中负责识别物质特有的差异。氨基酸在192(QR)位置上的置换会增加2个同种异型酶。在体外研究中Q型同种异型酶抵抗过氧化脂质在低密度脂蛋白的蓄积比R型能给予更大的保护。

2 PON与糖尿病眼部并发症

2.1 PON与糖尿病视网膜病变 PON表达酯酶活性和内酯酶活性，内酯酶活性作为糖尿病视网膜病变微血管并发症的一个危险因素在玻璃体方面的研究目前还没有报道。在体外研究中，将牛视网膜毛细血管内皮细胞暴露在同型半胱氨酸硫代内酯和同型半胱氨酸中，结果显示:PON-内酯酶活性和PON-2 mRNA表达存在剂量与时间的正相关，而且PON-内酯酶活性会增高2～3倍，但是酯酶活性是显著降低的。视网膜毛细血管内皮细胞对同型半胱氨酸转运的调节存在差异，而同型半胱氨酸化蛋白介导了糖尿病大血管和微血管并发症的形成和发展［14-15］。有研究报道，糖尿病患者血浆中PON-内酯酶活性和PON-酯酶活性是显著降低的［16］，糖尿病视网膜病变受试者玻璃体内的内酯酶和PON-内酯酶活性显著增高。玻璃体内的PON活性增高可能会导致内层视网膜屏障通透性的改变和内皮细胞的增殖，这正是糖尿病视网膜病变发病机制的特征。玻璃体内PON-内酯酶活性的增高对抵消同型半胱氨酸硫代内酯引起内皮细胞功能障碍有积极的意义［17］，同时增高的同型半胱氨酸可能会导致PON-酯酶活性的降低。

有报道称2型糖尿病患者的PON-1活性明显降低，而血浆氧化型低密度脂蛋白浓度增高。但个别研究者并不支持这个结论，指出PON对体内的低密度脂蛋白氧化没有作用［18］。1型糖尿病患者的PON-1活性亦处在一个较低的水平［19］。1型糖尿病患者无糖尿病视网膜病变组的PON-1活性与无糖尿病组相比无显著性降低，但1型糖尿病患者糖尿病视网膜病变组PON-1的活性比无糖尿病的对照组要低，而且也比无糖尿病视网膜病变组要低，这样可以确定脂质氧化在糖尿病视网膜病变的发病机制中扮演了一个重要的角色［20］。

血浆PON活性是糖尿病视网膜病变的重要因素，糖尿病微血管并发症的患者PON活性是降低的。糖尿病无并发症对照组的PON-1活性明显比患糖尿病视网膜组的高，但是浓度上2组没有差异。PON基因多态性能显著影响PON的活性。PON-1-55、PON-1-192和PON-2-310基因多态性的基因频率在研究人群中是没有差异的。对照组和2型糖尿病试验组的 PON-1-55、PON-2-310和 PON-1-192基因多态性影响PON-1的活性:同是2型糖尿病，PON-2-310CC基因型的个体比非此基因型个体的PON-1活性明显增高;同是PON-2-310CC基因型，无并发症组比糖尿病视网膜病变组PON-1浓度也显著降低。以上研究结果表明:2型糖尿病并发视网膜病变时，PON-2基因可影响PON-1基因，也可影响血糖的控制。血糖水平与血浆PON浓度及其生物活性呈负相关。血浆PON的浓度和活性可能会成为监测晚期微血管并发症的一个标志物。基因型CC(-107)、GG(-126)和CC(-907)都有相互独立的效应。糖尿病视网膜病变的发展与基因型CC(-907)有着非常显著的关联。在logistic回归模型中，等位基因CC(-907)、糖尿病病程长和高收缩压都是独立的危险因素。每一种基因型均能显著影响至少2种底物(对氧磷和乙酸苯酯)反应活性的一种。当底物是对氧磷，基因型55 L明显比基因型192 R的PON活性高，但是当底物是乙酸苯酯，结果则相反。GG(-907)纯合子的PON活性水平高，可以延缓糖尿病视网膜病变的进展［21］。PON-1CC(-907)和 GG(-907)编码了活性高的PON，但是在高密度脂蛋白对抗低密度脂蛋白的氧化作用时，这2种基因型的保护性却是最低的。多态性启动子CG(-907)可影响糖尿病视网膜病变的进展，如果一个等位基因C在-907位置出现，那么糖尿病视网膜病变的危险性会增加3倍［21］。在血管并发症中PON基因的作用是很复杂的，这可能牵涉到PON基因与糖尿病并发症患者的PON-1、PON-2、PON-3扩增的单链染色体基因之间的研究。大量研究也清晰地指出了PON-1基因多态性对PON活性的影响，也鉴定出具有糖尿病视网膜病变进展危险性的PON-1基因型。生理学上，PON基因型可能只会影响一部分PON活性，其他影响的因素可能还包括PON-2、PON-3基因的酶表达及其环境［21］。因此，未来的研究有必要鉴定和确定基因标志物，这样可以针对有危险因素的人群进行基因筛查。

2.2 PON与糖尿病性白内障 近来报道PON-1活性在糖尿病性白内障和年龄相关性白内障受试者的血浆中降低，在糖尿病性白内障受试者血浆中降低更显著［22］。在白内障受试者的血浆中PON-1活性处在一个下降的水平。随后检验了糖尿病性白内障组和非白内障组的 PON-1活性，发现白内障组PON-1活性显著下降。进一步对白内障患者的晶状体组织研究，RT-PCR分析提示存在PON-1 mRNA，而PON-2和PON-3的mRNA表达则未检测到。免疫组织化学分析中使用人类PON-1抗体，显示在晶状体赤道部抗体有较强的反应。此外，晶状体微粒体蛋白印迹分析证明了单条PON-1结合了自己的抗体，表明了PON-1蛋白在人类晶状体表达。PON-1酶活性检测提出，相比年龄相关性白内障，糖尿病性白内障患者晶状体内PON-1的活性是显著降低的。通过模式研究发现，PON-1的结构在糖化作用的影响下，其三维结构由重组的PON构成，这一结构具有六个β螺旋结构。戊糖苷残基附着于PON-1的赖氨酸70和赖氨酸75上，形成了糖化的异体PON-1［23］。

白内障是一类多因素引起的疾病，由于晶状体透明度的降低而导致的正常视觉受损。发病的机制之一是抗氧化剂和活性氧之间失衡而发生氧化损伤，使晶状体变成不透明。与自身其他的细胞一样，晶状体组织有维持氧化平衡的防御机制。早期的研究表明，在白内障的晶状体样本中有类似于过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽系统这样的抗氧化酶水平降低［24］。PON是抗氧化酶家族的新成员。

关于PON家族的组织分布，基因和蛋白表达的信息是非常有限的。最近有研究对正常小鼠PON-1、PON-2、PON-3的免疫化学定位发现，在小鼠晶状体内有PON-1和PON-3，该研究认为这2种蛋白的分布在小鼠与人之间是不同的［25］。后来的研究指出:在人晶状体组织只有PON-1存在，在晶状体的赤道部可观察到明显的染色，晶状体微粒体蛋白印迹分析证明了PON-1蛋白条带的存在，确认了PON-1的表达［23］。PON-1可能在局部合成保护晶状体组织免受氧化损害，这一论点已经在小鼠晶状体组织中予以证实。虽然PON生理学的底物认为未知，但是由于PON已被广泛认为有抗氧化的作用，所以PON-1在人晶状体中能检测到其表达并不出乎意料。

糖尿病的主要发病机制还不明确，但已有大量研究表明氧化应激是糖尿病的主要发病机制。氧化应激包括葡萄糖自氧化、高级糖基化终产物和多途径激活，所有过程都能在白内障的形成中观察到。因此，相比年龄相关性白内障，在糖尿病性白内障患者晶状体内发现更低水平的PON-1表达。由于氧化应激能使PON-1失活，而导致糖尿病受试者PON-1活性降低。脂质过氧化的程度与晶状体混浊的进展存在相关性［26］。PON有对抗低密度脂蛋白的氧化作用，丙二醛是脂质过氧化的标志物，是评价氧化应激程度常规分析的指标。研究者分析白内障晶状体组织里的丙二醛水平和PON-1的酶活性，结论与更早期的研究是一致的;相对于年龄相关性白内障，在糖尿病性白内障晶状体中丙二醛是显著增高的。此外，丙二醛水平和PON活性之间还存在一种负相关关系［23］。当PON-1被氧化的低密度脂蛋白抑制时，脂质过氧化和PON-1呈负相关。早期的研究表明，PON对糖化作用很敏感，糖化后PON活性会降低40%。对比无糖基化的结构，糖基化后PON-1结构显示，在顶部活性中心插入了戊糖苷，在底部有催化性的二联体和其他一些重要的残基。这表明氨基酸侧链的置换或是微小的改变都可能干扰邻近的残基或是引起钙结合部位大小的改变［27］。模型研究表明，PON-1的糖化发生在赖氨酸70和赖氨酸75，这可能对底物的结合产生了阻碍。在糖基化模型中，催化活性二元体的方向没有改变，但是在赖氨酸70和赖氨酸75上的戊糖苷分子存在影响了底物的结合，或是使得活性中心无法利用底物，结构上的改变降低了 PON 的活性［23］。

3 小结

1 型糖尿病视网膜病变患者其PON-1活性下降，表明PON-1在糖尿病视网膜病变的发病机制中起重要的作用。鉴定出具有糖尿病视网膜病变进展危险性的PON-1的基因型，则可针对有危险因素的人群进行基因筛查，对早期发现和预防提供参考依据。PON-1在糖尿病性白内障方面，今后要探索其在人白内障晶状体中的表达差异的作用机制。在晶状体内PON-1担任着抗氧化酶的角色，其在晶状体组织表达提供了一种研究由氧化应激而导致损伤的酶的作用模型。

在过去的10 a，人类流行病和实验研究已经证实PON发挥了重要的抗氧化保护性作用。这一发现使得PON的研究成为了一个重要的阐明疾病发病机制的途径。疾病的发病机制是一个复杂的现象，需进一步阐述在疾病发生过程中PON潜在功能中基因多态性的作用，且PON作为一种蛋白质，其活性有赖于正确的空间构象;形成其正确的空间构象有赖于细胞内特定的酶反应体系，今后还需进一步研究是酶反应体系对PON活性的改变机制。因此，对于疾病的干预，PON活性和基因突变的药理学调节可以构成一个有效的途径。目前PON已经深入地融汇到体内稳态机制的认识中。在不远的未来，PON激动剂的发展可能帮助我们对体内稳态紊乱有一个有效的治疗作用。

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