乳核内消液微生物限度检查方法学验证

兰鸿，李元宏，杨务彬

(湖北医药学院附属太和医院药学部，湖北十堰 442000)

乳核内消液功能主治为疏肝活血，软坚散结。处方中浙贝母、柴胡、赤芍、夏枯草均具有抑菌作用;按照2010年版《中华人民共和国药典》一部附录ⅩⅢC微生物限度检查法［1］的要求，笔者对乳核内消液进行了细菌数、真菌数和酵母菌数测定，及控制菌大肠埃希菌的检查，建立微生物限度检查方法，并加以验证［2］。

1 仪器与材料

1.1 仪器 LDZX-40BI立式自动电热压力蒸气灭菌器(上海申安医疗器械厂)，DNP-9162型电热恒温培养箱(上海精宏实验设备有限公司)，HH·B11·600型电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂)，LRH-150B生化培养箱(广东医疗器械厂)，超净台(苏净集团安泰公司)。

1.2 培养基 营养琼脂培养基，玫瑰红钠琼脂培养基，营养肉汤培养基，胆盐乳糖培养基，胆盐乳糖发酵培养基，乳糖发酵培养基，改良马丁培养基，改良马丁琼脂培养基，4-甲基伞形花内酯-β-D-葡萄糖苷酸培养基，曙红亚甲蓝琼脂培养基(四川省食品药品检验所)。

1.3 阳性对照菌 金黄色葡萄球菌［CMCC(B)26003］，大肠埃希菌［CMCC(B)44102］，枯草芽孢杆菌［CMCC(B)63501］，白念珠菌［CMCC(F)98001］，黑曲霉菌［CMCC(F)98003］(四川省食品药品检验所)。

1.4 供试品 乳核内消液(四川省新鹿药业有限公司，批号:100401，100402，100403)。

2 方法与结果

2.1 供试液制备 取供试品10 mL，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 mL，混匀，作为1∶10供试液。

2.2 阳性对照菌液的制备 取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物接种于营养肉汤培养基中，30～35℃培养18 h，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍递增稀释制成每毫升含菌数为50～100 cfu的菌悬液，备用;接种白念珠菌的新鲜培养物于改良马丁琼脂培养基中，25℃培养24 h，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍递增稀释制成每毫升含菌数为50～100 cfu的菌悬液，备用;接种黑曲霉菌的新鲜培养物于改良马丁琼脂斜面培养基上，25℃培养5 d，加入含容积分数为0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液5 mL将孢子洗脱，吸出孢子悬液至无菌试管内，用含容积分数为0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液10倍递增稀释制成每毫升含孢子数50～100 cfu的孢子悬液，备用［3］。

2.3.1 常规法 取供试液1 mL注入平皿。

2.3.2 培养基稀释法 第一法:取供试液1 mL注入5个平皿中(每个平皿0.2 mL);第二法:取供试液1 mL注入10个平皿中(每个平皿0.1 mL)。

2.3.3 薄膜过滤法 取供试液10 mL，加至pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100 mL中，混匀，薄膜过滤，总冲洗量为300 mL。

2.4 回收率实验

2.4.1 实验组 取规定量供试液及各实验菌50～100 cfu，分别注入同一平皿中，立即倾注琼脂培养基，平行制备2个平皿，凝固后，置规定温度下，细菌培养24～48 h，白念珠菌和黑曲霉菌培养48～72 h。

2.4.2 菌液组 取各实验菌50～100 cfu注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，平行制备2个平皿，凝固后，置规定温度下，细菌培养24～48 h，白念珠菌和黑曲霉菌培养48～72 h，测定所加入的实验菌数。

2.4.3 供试品对照组 取规定量供试液，立即倾注琼脂培养基，凝固后，置规定温度下，细菌培养24～48 h，白念珠菌和黑曲霉菌培养48～72 h，测定供试品本底菌数。

2.4.4 稀释剂对照组 取稀释剂pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液1 mL和实验菌50～100 cfu，分别注入同一平皿中，考察稀释剂对实验有无干扰［4］。

2.4.5 回收率的计算 回收率(%)=(实验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数)/菌液组平均菌落数×100%。

马克思主义认为公共产品供给方式与生产力的发展水平是呈正相关的，当社会经济发展水平低的时候，公共产品供给方式比较单一，而当社会经济发展水平较高时，就可以采取多种方式实现公共服务供给［8］179。在《不列颠在印度的统治》中，马克思通过对东西方节约用水和共同用水方式比较，得出在西方经济发展高的国家除采取政府供给方式外还可以采取私人企业家联合供给的方式，而在东方则由于工业文明程度低，只能采用政府单一供给的方式。

2.5 稀释剂干扰实验 使用常规法对稀释剂进行回收率实验，结果稀释剂对照组大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白念珠菌、黑曲霉菌平均回收率分别为94.5%，105.3%，98.9%，95.8%，93.3%，表明稀释剂pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液无抑菌作用，对实验无干扰，见表1。

2.6 细菌数、真菌数和酵母菌数测定方法的确定对乳核内消液按常规法、培养基稀释法(每个平皿0.2 mL)、培养基稀释法(每个平皿0.1 mL)、薄膜过滤法(每个平皿冲洗量300 mL)的顺序进行实验。在薄膜过滤法实验中，另设稀释剂对照组，取稀释剂10 mL，薄膜过滤，用0.9%氯化钠溶液冲洗3次，每次100 mL，在最后一次冲洗液中加入实验菌50～100 cfu，过滤，取出滤膜，菌面朝上贴于琼脂平板，置规定温度培养48h观察，测定稀释剂对照组的回收率。用3批乳核内消液样品进行验证。见表2，3。

表1 稀释剂回收实验结果cfu

表2 消除供试品抑菌活性回收率 %

乳核内消液的微生物限度检验结果表明，真菌、酵母菌采用常规法其回收率均＞70%，采用薄膜过滤法(每个平皿冲洗量300 mL)，可确保细菌数的回收率均＞70%，符合《中华人民共和国药典》的规定，方法可行。

表3 乳核内消液回收率实验结果 %

2.7 控制菌大肠埃希菌检验方法的建立及验证

2.7.1 菌液制备 菌液制备同“2.2”。

2.7.2 常规法 实验组:取1∶10供试液10 mL接种至100 mL胆盐乳糖培养基，同时加入大肠埃希菌50～100 cfu，35℃培养24～48 h。取培养物0.2 mL接种至含4-甲基伞形花内酯-β-D-葡萄糖苷酸培养基5 mL的试管中，35℃培养24 h，366 nm紫外灯下观察荧光，然后进行靛基质实验。另取培养物划线接种于署红亚甲蓝平板，35℃培养18～24 h，观察其菌落形态。阴性菌对照组:取金黄色葡萄球菌作为阴性对照实验菌，方法同实验组。

常规法实验结果:经胆盐乳糖培养基增菌培养后，实验组有明显产酸产气现象，检出大肠埃希菌，而阴性对照组未检出大肠埃希菌。结果表明采用常规法进行大肠埃希菌检验，方法成立。见表4。

表4 大肠埃希菌检查常规法实验结果

3 讨论

使用常规法对稀释剂进行回收率实验，结果5种实验菌株的回收率均＞70%，表明稀释剂pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液无抑菌作用，对实验无干扰。薄膜过滤法另设的稀释剂对照组，其3次独立实验稀释剂对照组回收率(稀释剂对照组平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率)均＞70%，同时，实验组的菌数回收率均＞70%，证明采用薄膜过滤法(每个平皿冲洗量300 mL)可有效消除供试品的抑菌作用，并且证明该验证实验结果有效。

经方法验证生产企业在原、辅料、生产和检验等条件不变的情况下，乳核内消液的微生物限度检查方法:细菌计数方法为薄膜过滤法(每个平皿冲洗量300 mL)，真菌及酵母菌计数方法为常规法，控制菌大肠埃希菌检查采用常规法。

［1］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)［M］.北京:中国医药科技出版社，2010:附录79.

［2］ 颜栋林，李萍，兰茜.柴黄片微生物限度检查法方法验证［J］.中国当代医药，2009，16(16):7-8.

［3］ 张广求.十九味赤芍胶囊微生物限度检查方法的建立［J］.医药导报，2009，28(8):1075-1076.

［4］ 张丽梅，李俊，邢建华.抗生丸微生物限度检查法的验证［J］.医药导报，2009，28(6):792-793.