盐酸小檗碱与8-羟基二氢小檗碱对大鼠脑组织与血清中乙酰胆碱酯酶活性的影响*

王开富，徐丽君，邹欣，陆付耳

(华中科技大学同济医学院附属同济医院中西医结合研究所，武汉 430030)

黄连用于治疗消渴(相当现代医学的糖尿病)有近2 000 a的历史，从黄连提取出盐酸小檗碱有约70 a的历史，在20世纪80年代即有大量的临床、实验研究证实小檗碱具有确切的降血糖作用［1-2］。其后，人们对小檗碱抗糖尿病的作用机制进行了广泛研究［3］。笔者观察了盐酸小檗碱和8-羟基二氢小檗碱对大鼠血清和脑匀浆中乙酰胆碱酯酶(acetylcholine esterase，AChE)的抑制作用，比较盐酸小檗碱和8-羟基二氢小檗碱治疗糖尿病的作用机制。

1 材料与方法

1.1 药品和试剂 AChE测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)，双缩脲总蛋白测定试剂盒(南京建成生物工程研究所);盐酸小糪碱、8-羟基二氢小檗碱均溶于无水乙醇，并用无水乙醇稀释成所需浓度，由华中科技大学同济医学院附属同济医院中西医结合研究所提供。

1.2 AChE样本的制备 SD大鼠，由华中科技大学同济医学院动物中心提供，动物合格证号:SCXK(鄂)2004-0007，体质量(200±20)g。腹主动脉取血5 mL后断头处死，冰台快速取大脑，放入玻璃皿中，玻璃皿加入少量冰冻的磷酸盐缓冲液(磷酸盐缓冲液漂洗，用干净的滤纸吸去大脑组织表面的水分和血液，称质量)，用眼科剪尽快剪碎组织块。将剪碎的组织倒入玻璃匀浆器中，再用少许冰冻磷酸盐缓冲液冲洗残留在烧杯中的碎组织块，一起倒入匀浆器中进行冰浴匀浆。然后再加入冰冻的磷酸盐缓冲液，按脑组织质量与匀浆总体积1∶10的比例，稀释混匀。将制备好的10%脑匀浆以3 000 r·min-1离心15 min(2-16K台式高速离心机，德国制造)，取上清液待测。取出的血以1 000 r·min-1离心8min，取血清。检测时将血清用磷酸盐缓冲液按1∶9稀释。

1.3 总蛋白含量的测定 用双缩脲法测得大鼠脑组织匀浆总蛋白量为3.18 g。

1.4 大鼠血清与脑匀浆AChE活力测定 用改良Ellman比色法测定 AChE活力，按AChE测定试剂盒方法测定。设标准管组、不加药测定管组、受试化合物(加盐酸小檗碱或8-羟基二氢小檗碱)测定管组，每组均设空白对照管和测定管，大鼠脑组织匀浆液和血清取样量为每管30μL。反应体系混匀，37℃准确反应6 min，然后终止反应，混匀放置 15 min，在波长412 nm测定各管吸光度A(用磷酸盐缓冲液调零)。受试药盐酸小檗碱、8-羟基二氢小檗碱分别配制成0.007，0.015，0.030，0.062，0.125，0.250，0.500，1.000 mg·mL-1。按下列公式测得盐酸小糪碱、8-羟基二氢小檗碱对AChE的抑制率。

脑匀浆中 AChE活力 (U·mg-1)=(A测定管-A对照管)/(A标准管-A空白管) × 标准管浓度(1 μmol·mL-1)/蛋白量(mg·mL-1)。

每毫克组织蛋白样本在37℃保温6 min，水解反应体系中1μmol基质为1个活力单位 (U)。

血清中 AChE活力 (U·mL-1)=(A测定管-A对照管)/(A标准管-A空白管)× 标准管浓度 (1 μmol·mL-1)×样品测试前稀释倍数。

每毫升血清样本在37℃保温6 min，水解反应体系中1μmol基质为1个活力单位(U)。

1.5 统计学方法 采用两样本均数比较的t检验，结果以均数±标准差(x±s)表示。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

盐酸小檗碱、8-羟基二氢小檗碱对大鼠脑组织和血清AChE活性均有明显的抑制作用，抑制程度与盐酸小檗碱和8-羟基二氢小檗碱的浓度具有明显的量效关系，见表 1，2。

3 讨论

已经阐明2型糖尿病发病的两个最根本的环节是胰岛素分泌缺陷和胰岛素抵抗。然而，AChE活性增高也是2型糖尿病的病理现象之一。研究发现，2型糖尿病患者血清AChE活性显著高于正常人群;2型糖尿病大鼠血清和脑组织AChE活性显著高于对照组，提示糖尿病病程中某些组织器官伴有AChE活性异常增高，那么AChE活性升高与血糖控制有何关联?将胆碱酯酶抑制药(溴化新斯的明)给糖尿病家兔肌内注射后，发现家兔血清胰岛素水平明显升高，血糖下降，糖化血红蛋白降低，表明2型糖尿病与AChE之间存在密切的关系［4-5］。

NAKANO等［6］报道，激活胆碱能受体或增加乙酰胆碱可以促进β细胞钙离子(Ca2+)内流引起三磷腺苷依赖性钾通道关闭而促进胰岛素颗粒释放和分泌。然而，AChE能专一性地水解乙酰胆碱成胆碱和乙酸。尽管还不清楚为什么2型糖尿病患者AChE活性增高，但可以肯定AChE活性升高势必加速对乙酰胆碱的破坏而导致乙酰胆碱减少，从而影响胰岛素分泌，这可能是血糖调节障碍的重要原因之一。

表1 不同浓度盐酸小檗碱对大鼠脑组织和血清中AChE的抑制作用Tab．1 The inhibitory effect of berberine hydrochloride of different cencentration on AChE activity in the cerebral tissue and serum of rats ± s，n=10

表1 不同浓度盐酸小檗碱对大鼠脑组织和血清中AChE的抑制作用Tab．1 The inhibitory effect of berberine hydrochloride of different cencentration on AChE activity in the cerebral tissue and serum of rats ± s，n=10

与不含盐酸小檗碱组比较，*1 P＜0.01，*2 P＜0.05Compared with the group without berberine hydrochloride，*1 P ＜0.01，*2 P ＜0.05

盐酸小檗碱浓度/(mg·mL-1)大鼠/只脑组织AChE活力/(U·mg-1)AChE抑制率/%血清AChE活力/(U·mL-1)AChE抑制率/%0.007 10 0.998±0.126*1 52.57 5.541±2.004 8.44 0.015 10 0.980±0.113*1 53.42 4.533±1.102*2 25.10 0.030 10 0.914±0.164*1 56.56 3.468±0.906*1 42.70 0.062 10 0.852±0.137*1 59.51 2.512±0.675*1 58.49 0.125 10 0.812±0.124*1 61.41 1.523±0.326*1 74.83 0.250 10 0.672±0.108*1 68.06 0.986±0.284*1 83.71 0.500 10 0.421±0.096*1 79.99 0.730±0.057*1 87.94 1.000 10 0.374±0.067*1 82.22 0.025±0.007*1 99.59 0.000 10 2.104±0.272 … 6.052±2.384…

表2 不同浓度8-羟基二氢小檗碱对大鼠脑组织和血清中AChE的抑制作用Tab．2 The inhibitory effect of8-hydroxy dihydroberberine of different cencentration on AChE activity in the cerebral tissue and serum of rats ± s，n=10

表2 不同浓度8-羟基二氢小檗碱对大鼠脑组织和血清中AChE的抑制作用Tab．2 The inhibitory effect of8-hydroxy dihydroberberine of different cencentration on AChE activity in the cerebral tissue and serum of rats ± s，n=10

与不含8-羟基二氢小檗碱组比较，*1 P＜0.05，*2 P＜0.01Compared with the group without8-hydroxy dihydroberberine，*1 P ＜0.05，*2 P ＜0.01

8-羟基二氢小檗碱浓度/(mg·mL-1)大鼠/只脑组织AChE活力/(U·mg-1)AChE抑制率/%血清AChE酶活力/(U·mL-1)AChE抑制率/%0.007 10 1.708±0.247*1 32.78 6.220±1.389 11.72 0.015 10 0.906±0.156*2 64.34 5.706±1.675*1 19.02 0.030 10 0.987±0.143*2 61.16 4.925±1.003*2 30.10 0.062 10 0.906±0.128*2 64.43 3.522±0.989*2 50.01 0.125 10 0.826±0.097*2 67.49 2.497±0.894*2 64.56 0.250 10 0.303±0.084*2 88.08 1.511±0.643*2 78.56 0.500 10 0.223±0.065*2 91.22 0.322±0.068*2 95.43 1.000 10 0.098±0.003*2 96.14 0.029±0.004*2 99.59 0.000 10 2.541±0.383 … 7.046±2.574…

本研究结果表明，盐酸小檗碱和8-羟基二氢小檗碱对大鼠脑组织和血清中AChE活性均有明显的抑制作用，且抑制程度与盐酸小檗碱和8-羟基二氢小檗碱的浓度具有明显的量效关系;另有研究表明:黄连中含

有5种分子结构十分相似的物质，即小檗碱、药根碱、巴马汀碱、表小檗碱和黄连碱。这5种生物碱中只有小檗碱和药根碱具有降糖作用，且小檗碱降糖效果强于药根碱［7］，抑制AChE活性可能是小檗碱发挥降糖功效的作用机制。

尽管小檗碱临床应用多年，但由于小檗碱降糖的作用机制迄今尚不完全清楚，加上小檗碱吸收差、生物利用度低等特点可能导致其在降糖作用强度上比较温和，因而目前尚未能在临床广泛地用于治疗2型糖尿病。为了增加小檗碱的吸收，笔者将其改造为8-羟基二氢小檗碱。本实验证明，改造后的小檗碱对AChE活性也具有明显的抑制作用。体外实验结果显示，8-羟基二氢小檗碱与盐酸小檗碱对大鼠AChE的抑制作用虽没有明显差异，但改造后的小檗碱增加了生物利用度，只需口服较小剂量，就能发挥对AChE的抑制作用。小檗碱的分子结构明确，如果上述推测得以证实就可以确定AChE为小檗碱作用的新靶点，这对中药单体的研究将是一大突破，不仅可以科学阐明小檗碱治疗糖尿病的机制而促进其临床应用，而且还可以针对其吸收差、生物利用度低等特点运用生物转化技术在小檗碱系列衍生物中筛选出吸收更好、效应更强的降糖单体，这些有待进一步研究。

［1］ 陈其明，谢明智.黄连及小檗碱降血糖作用的研究［J］.药学学报，1986，21(6):401-406.

［2］ LENG SH，LU F E，XU L J.Therapeutic effects of berberine in impaired glucose tolerance rats and its influence on insulin secretion［J］.Acta Phar Sin，2004，25(4):496-502.

［3］ 舒适，刘小美，宋丽娜，等.小檗碱对 2型糖尿病大鼠IRS21/22、p85基因表达的影响［J］.浙江中医杂志，2009，4(44):254-256.

［4］ 耿明霞，王开富，陈卫红，等.2型糖尿病患者血清胆碱酯酶检测的临床价值［J］.公共卫生与预防医学，2005，16(5):70-71.

［5］ 王开富，陆付耳，徐丽君，等.胆碱酯酶抑制药对化学性糖尿病影响的实验研究［J］.中国病理生理杂志，2004，20(9):1586-1596.

［6］ NAKANO K，SUGA S，TAKEO T，et al.Intracellular Ca2+modulation of ATP-sensitive K+channel activity in acetylcholine-induced activation of rat pancreatic beta-cells［J］.Endocrinology，2002，143(4):569-576.

［7］ 付燕，胡本容，汤强，等.药根碱、小檗碱、黄连煎剂及模拟方对小鼠血糖的影响［J］.中草药，2005，36(4):548-551.