益生菌抗热保护剂的研究

范娜，陈雪峰

（陕西科技大学生命科学与工程学院，陕西 西安 710021）

益生菌抗热保护剂的研究

范娜，陈雪峰*

（陕西科技大学生命科学与工程学院，陕西 西安 710021）

益生菌抗热保护剂的研究一直是工业化大规模生产益生菌产品的热点与难点。本文选取海藻糖、明胶和甘油作为抗热保护剂，研究其对嗜酸乳杆菌和双歧杆菌混合菌体的抗热保护效果。结果表明，海藻糖、明胶和甘油均能够提高菌体的抗热存活率，可以作为抗热保护剂。3种保护剂之间存在交互作用，复合使用时的抗热保护效果比单独使用时好，其最佳复合配方为海藻糖16%、甘油6%、明胶0.14%，菌体存活率可达16.58%，活菌数为1.66×108cfu/mL。

嗜酸乳杆菌；双歧杆菌；抗热保护剂

近年来，随着人们对功能性食品要求的日益上升，益生菌产品成为促进人们身体健康的重要产品之一，尤其是作为日常食品，它们占据着世界65%的功能性食品市场[1]。FAO/WHO将益生菌定义为“当摄入一定量时能对宿主健康有作用的微生物活体”。嗜酸乳 杆 菌 （Lactobacillus acidophilus） 和 双 歧 杆 菌（Bifidobacterium）是宿主（人和动物）肠道中的重要微生物，其能顺利通过胃肠环境而定植肠内，当达到一定数量时，能够改善、调节宿主肠道内微生物菌群的平衡，增强机体的免疫力，降低胆固醇水平以及抑制肿瘤细胞的形成等[2]。

然而，食品中活性益生菌保护的技术仍是一个巨大的难题，尤其是利用喷雾干燥法大规模生产粉状活性益生菌产品的菌体抗热性保护技术研究还很少。研制高活性粉状益生菌产品的关键在于保护剂的使用。海藻糖、甘油和明胶是冷冻干燥技术中常用的菌体活性保护剂，但其对于菌体的抗热保护效果目前研究较少，仅有戴秀玉[3]等讨论了海藻糖对于嗜热链球菌的高温耐受性；吕嘉枥[4]等探讨了甘油等在72℃保温30 min的条件下对嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌抗湿热保护的影响；成妮妮[5]研究了动物、植物和微生物细胞中的提取物对菌体抗热性的影响。本文选取海藻糖、甘油和明胶这3种物质作为抗热保护剂，探讨其对嗜酸乳杆菌和双歧杆菌混合菌株的抗热保护效果，从而为工业化生产粉状活性菌体产品提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

嗜酸乳杆菌和双歧杆菌混合菌种为陕西科技大学食品科学研究室保藏。

海藻糖、甘油、明胶均为食品级。使用1/15 mol/L、pH6.98的磷酸盐缓冲溶液将明胶溶解配制成所需浓度的溶液，114℃、灭菌10 min，冷却后4℃冰箱中保存备用。使用前在37℃水浴中预热10 min[6]。海藻糖和甘油使用无菌水配制成所需浓度的溶液，无菌微孔滤膜过滤（现用现制）。配制的保护剂溶液确认无菌后方可使用。

MRS液体培养基[7]：用于菌体扩大培养。

MRS固体培养基：在液体培养基的基础上加入1.5%的琼脂即可，用于菌落计数。

1.2 仪器与设备

SW-CJ-ID型淡然净化工作台：苏州净化设备有限公司；GH4500型隔水式恒温培养箱：天津泰斯特有限公司；PB-10酸度计：德国赛多利斯科学仪器有限公司；UV-754型紫外分光光度计：上海第三分析仪器厂；XS-402型显微镜：南京江南永新光学仪器有限公司；高压蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂；H1850R型高速冷冻离心机：长沙湘仪离心机仪器有限公司；HH-4数显恒温水浴锅：国华电器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌种活化及扩大培养

将嗜酸乳杆菌和双歧杆菌混合菌种由固体斜面培养基接入液体培养基中，37℃恒温培养24 h，反复活化2次～3次。将活化好的纯菌种以4%的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃恒温箱中进行扩大培养。

1.3.2 菌体生长特性的测定及收集

菌体扩大培养时每隔2 h取样进行活菌计数，同时测定培养液pH值和600 nm下吸光值（OD值），绘制菌体生长曲线，确定出菌体最佳收集时间。

扩大培养的菌液10℃下，6000 r/min离心15 min，弃上清液，用无菌生理盐水冲洗沉淀，制成活菌数为1.0×109cfu/mL的菌悬液。

1.3.3 单一保护剂对菌体抗热性的影响

海藻糖、甘油、明胶3种保护剂浓度水平如表1。菌悬液中加入保护剂后于75℃保温30 min[5]，进行活菌计数并计算存活率。

表1 单因素试验设计Table 1 Single factor experiment design

1.3.4 复合保护剂对菌体抗热性的影响

由单因素实验结果，利用SAS9.0软件中的Box-Behnken试验设计，设计复合保护剂配方因素水平表（表 2）。

表2 Box-Behnken设计试验因素水平Table 2 Factor level of Box-Behnken design

1.3.5 活菌计数：平板计数法[8]。

活菌数（cfu/mL）=3个平行平均菌落数×稀释倍数/接种量（mL）

存活率=（保温后活菌数/保温前活菌数）×100%

2 结果与分析

2.1 菌体生长特性的测定

菌种扩大培养过程中菌体在MRS液体培养基中的活菌数、OD值及pH值变化如图1所示。

图1 MRS培养基中菌体生长曲线Fig.1 Probiotics growth curve on MRS medium

从图1可以看出，培养0～6 h，培养液pH值缓慢下降、OD值缓慢上升，活菌数由起始浓度5.62×104cfu/mL仅上升到1.41×105cfu/mL，菌体数量增加缓慢，这一时期菌体处于生长延滞期；在6 h～18 h，pH变化很大，OD值和菌体数均增长很快，菌体处于对数生长期；18 h后，pH值、OD值和活菌数都基本保持稳定，变化很小，表明此时菌体生长进入稳定期，同时产生大量的代谢产物，此时最大活菌数为1.05×108cfu/mL；24 h时，活菌数略有下降，菌体衰亡速率大于生长繁殖速率，开始进入衰亡期，这是由于培养液中可利用的营养物质缺乏，培养体系中pH较低抑制了菌体的生长。其生长周期符合一般细菌的生长规律。

根据MRS培养基中菌体生长曲线，可以确定4%接种量、37℃恒温培养的菌体最佳收获期应在18 h～20 h，即在刚刚进入稳定生长期时收集菌体，能够获得较多的活性菌体。

2.2 单一保护剂对菌体抗热性的影响

加入不同保护剂75℃保温30 min后，菌体存活率见表3。

表3 单一保护剂对菌体存活率的影响Table 3 The effects of single protective agent on the rate of the survival probiotics

由表3可看出，加入保护剂后经热处理过的菌体均呈现出一定的存活率（不加保护剂，同样条件下热处理后菌体存活率为零），说明所选择的3种保护剂都可以提高菌体的抗热性。3种保护剂中，明胶的保护效果最好，菌体存活率最高可达12.72%；海藻糖次之，菌体存活率最高为11.87%；甘油最小，为11.47%。其中，使用明胶的菌体存活率随其使用浓度的增大而逐渐提高，但使用浓度大于0.15%后，菌体存活率上升幅度很小；而使用海藻糖和甘油的菌体存活率，都呈现出随其用量的增加先上升后下降的趋势。这表明保护剂的种类不同对菌体的抗热保护效果也各不相同，这与吕嘉枥等[4]在72℃保温30 min的条件下得到的有关甘油等对嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌抗湿热保护的研究结果类似；同一保护剂对菌体的抗热保护效果随其使用浓度的不同亦不同，3种保护剂各自适宜的使用浓度分别为：海藻糖15%、甘油6%、明胶0.15%。

2.3 复合保护剂对菌体抗热性的影响

2.3.1 Box-Behnken实验设计结果

以3种保护剂为3个自变量，菌体存活率为响应值，对嗜酸乳杆菌和双歧杆菌混合菌种的抗热保护剂配方进行优化，Box-Behnken设计法进行实验后所得结果如表4。

表4 Box-Behnken设计方案及结果Table 4 Program and results of Box-Behnken design

2.3.2 回归方程的建立

对Box-Behnken试验的结果（表4）进行方差分析和响应面二次回归模型拟合，有关参数见表5。

表5 回归模型方差分析Table 5 ANOVA for response surface quadratic model

由表5看出，选取95%的置信度，海藻糖、明胶以及它们的二次项及其3种保护剂之间的交互效应对菌体抗热存活率的影响都显著，而甘油对菌体的抗热存活率影响不显著。因此，各实验因素与响应值之间存在非线性关系，拟合的二次模型为Y=－24.9993+2.4586X1+296.111X3－0.0542X1X1+0.0732X2X2－666.217X3X3－0.0098X1X2－5.4826X2X3－4.7200X1X3。在表 5中，相关系数（R-square）=99.12%，失拟项（Lack of fit）=0.367376为不显著，说明所拟合的二次模型信任度高，能够进行实验预测。

2.3.3 响应面因子水平优化

用SAS对响应面模型进行典型性分析（canonical analysis）,可知响应值Y（菌体存活率）对因子X1（海藻糖）与X3（明胶）的改变更敏感，因子X2（甘油）不显著，固定X2用量（甘油X2=6%），生成X1与X3对Y的响应面趋势图和等高线图，如图2。

图2 海藻糖和明胶对菌体存活率影响的响应面分析图（a）和等高线图（b）Fig.2 Surface plot and contour plot of effects of trehalose and gelatin on the rate of the survival probiotics

由响应面趋势图可看出，当明胶使用浓度一定时，海藻糖对菌体存活率的影响随其用量的增加逐步升高最终趋缓；而固定海藻糖用量时，明胶对菌体存活率的影响随其浓度的增加呈先上升后下降的趋势。这一点与单因素试验结果不相一致。这可能是由于保护剂复配使用后，它们之间存在交互效应所致。等高线图中，等高线呈现明显的椭圆，亦说明海藻糖和明胶间的交互效应显著。因此，对响应值进行岭脊分析，得出Y取最大值（16.4776%）时的因子水平代码值为（X1=0.17019，X2=0.00731，X3=-0.16162），再结合表 43 个因子对Y的显著性影响，可选取嗜酸乳杆菌和双歧杆菌混合菌种抗热保护剂的最佳配方为：海藻糖15.85%、甘油为6%、明胶0.14%。

通过验证实验，嗜酸乳杆菌和双歧杆菌混合菌体在使用复合保护剂（海藻糖16%（近似）、甘油6%、明胶0.14%）后，75℃保温30 min处理，菌体存活率可达16.58%，与数学模型预测的菌体存活率基本相符，说明响应面法得到的数学模型与实验数据拟合较好。

3 结论与讨论

本试验所选择的3种物质均能一定程度的提高菌体抗热性，这与它们各自的特性密切相关。海藻糖能够渗透到细胞内部并填充在蛋白质等活性大分子周围，当细胞外温度较高时，细胞会失水而海藻糖的羟基可与生物分子的极性基团形成氢键，代替极性基团周围失去的水分子，从而维持蛋白质分子的稳定性[9-10]。甘油属低分子中性物质，在溶液中易结合水分子，发生水合作用，使溶液的黏性增加，从而减轻了细胞外溶质浓度升高所造成的细胞损伤。同时，甘油进入细胞后，使细胞内溶质度升高，细胞内压力接近于细胞外压力，减少了细胞受热时脱水的程度和速度[5]。明胶是一种变性蛋白质，具有凝集作用[11]，在热水中会形成热可逆性凝胶，它具有优良的持水性，可阻止细胞变形从而提高菌体的抗热性。

根据SAS9.0软件响应面分析方法，优化后的复合保护剂配方为：海藻糖16%、甘油6%、明胶0.14%，在75℃保温30 min的处理下，菌体存活率可达到16.58%，活菌数为1.66×108cfu/mL。较成妮妮[5]报道的相关嗜酸乳杆菌的复配抗热保护剂配方中菌体最大存活率（仅0.2329%）有很大提高。本研究所得的保护剂配方虽能够提高嗜酸乳杆菌和双歧杆菌混合菌体的抗热性，但能否用于喷雾干燥过程中的抗热保护还有待进一步研究。

[1]Thomas Heidebach,Petra Forst,Ulrich Kulozik.Microencapsulation of probiotic cells by means of rennet-gelation of milk proteins[J].Food hydrocolloids，2009(23):1670-1677

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[3]戴秀玉,沈义国,周坚.海藻糖对乳酸菌的抗逆保护研究[J].微生物学通报,2001,28(2):46-50

[4]吕嘉枥,张淑娟,董云森，等.乳酸菌抗湿热保护剂的研究[J].西北轻工业学院学报,2002,4(20):29-33

[5]成妮妮.嗜酸乳杆菌抗热保护剂的研究[J].食品研究与开发,2003,24(6):51-53

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[7]刘慧,张红星.现代微生物学实验技术[M].北京：中国轻工出版社,2008:16-18

[8]杜鹏.乳品微生物学实验技术[M].北京：中国轻工出版社,2008：21-23

[9]田洪涛,贾英民.海藻糖在双歧杆菌冻干菌粉制备和保藏中生物保护作用的初探[J].河北农业大学学报,2000,23(2)：62-65

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[11]林云.双歧杆菌冻干保护剂条件的研究[J].饲料研究,2002(6)：4-7

Study of Thermal Resistant Protective Agents of Probiotics

FAN Na,CHEN Xue-feng*
（College of Life Science and Engineering，Shaanxi University of Science and Technology，Xi’an 710021，Shaanxi，China）

The study about the thermal resistant protective agents of probiotics was the hot and difficult subject in the manufacturering of the probitic products on large industrial scale.Trehalose,gelatin and glycerin were used as thermal resistant protective agents to evaluate their thermal resistant protective effects on probiotics mixture of Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium.The results indicated that trehalose,gelatin and glycerin,which were able to improve the thermal resistant survival rate of probiotics,can be used as thermal resistant protective agents.The protective effects of composite agents were better than the single one due to the interactive effects of the three agents.The optimal composition of protective agents were trehalose 16%,glycerin 6%and gelatin 0.14%,then the rate of the survival probiotics reached 16.58%,the viable cell numbers was 1.66×108cfu/mL.

bifidobacterium；Lactobacillus acidophilus；thermal resistant protective agent

陕西科技大学博士科研启动基金项目（BJ09-22）

范娜（1986—），女（汉），硕士研究生，研究方向：食品生物技术。

*通信作者：陈雪峰（1964—），教授，博士生导师，研究方向：食品加工。

2010-09-21