5种水溶性维生素在奶粉中的稳定性研究

刘志楠，喻东威，赵源，刘晓川，李梅，赵雅丽

（内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司质量管理系统分析检测中心，内蒙古 呼和浩特 011500）

5种水溶性维生素在奶粉中的稳定性研究

刘志楠，喻东威，赵源，刘晓川，李梅，赵雅丽

（内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司质量管理系统分析检测中心，内蒙古 呼和浩特 011500）

微生物法检测奶粉中水溶性维生素，为美国公职分析化学家协会AOAC要求的官方检测方法，也为国标所采纳，一直沿用至今。其灵敏度高，已被全世界所公认。但该法操作复杂，影响结果的因素很多，对检验人员和实验室的要求较高。针对这一问题采取对同一样品进行大量的实验，以确定其波动性，为乳制品的检测提供有力的数据支持。选取同一包奶粉进行多次重复测定，观察其样品与平均值的分布情况，相对标准偏差以及CV值。烟酸、泛酸、叶酸、VB12稳定性较好，生物素相对次之；烟酸和泛酸重复测定的精密度最好，叶酸和VB12相对较好，生物素精密度次之。

微生物法；烟酸；泛酸；叶酸；VB12；生物素；CV 值

维生素是维持生物正常生命过程所必需的一类小分子有机物，需要量很少，但对维持健康十分重要。维生素不能供给机体热能，也不能作为构成机体组织的相应物质，其主要功能是通过作为辅酶的成分调节机体代谢。大多数的维生素体内一般不能合成或合成量不能满足生理需要，必须从食物中摄取。长期缺乏任何一种维生素都会导致相应的疾病。

水溶性维生素也叫B族维生素，包括烟酸、泛酸、叶酸、VB12、生物素等12种水溶性维生素。多数维生素的性质不稳定，对光、氧、热、pH等非常敏感，食物在加工、储存、运输、销售等一系列环节都可能造成维生素的损失。为了弥补这种损失，维生素常常作为强化剂在食品工业的某些产品中使用。将合成的B族维生素添加到食品中补偿人体生长和健康的需要已经成为一种世界范围内的行动。

维生素是在食品中添加的微量生物活性成分，必须通过检测来严格控制其在食品中的添加量。由于维生素通常是预混在食品中，所以具体的检测工作常常在添加到食品之前进行；当然对于储存一段时间后的食品，还应在之后重新检测。

此外，为了评价食品标签上标注成分的准确性。美国食品和药物管理局FDA规定维生素在食品中的实际添加量必须为标签上标注量的100%或更多,而原生维生素产品中的维生素含量必须为标签上标注量的80%或更多（合理的超出部分通常认为是厂家在正常生产过程中产的）,European Directive2002/46/EC也制定了一系列法规,用于检测添加过维生素的食品中标注的维生素含量[1]。

2010年我国针对食品安全体系存在的一些列问题作出了相应的规定，出台了最新国家标准作为检测乳品中各种营养素的国家强制性检测标准，国标GB5413-2010[2-6]《乳产品标准及标准检验方法》对婴幼儿配方食品与奶粉中维生素含量的检测方法、检测限度、适用范围等都做了明确的规定。

目前我国维生素检测相关标准涉及的方法有微生物法和高效液相色谱法。其中微生物法为水溶性维生素通用方法，为烟酸、泛酸、叶酸、VB12、生物素所共用，高效液相色谱法仅应用于烟酸和泛酸。

1 材料与方法

1.1 材料

奶粉。

1.2 试剂及设备

VB12、烟酸、叶酸、泛酸、生物素检测培养基及标准品：购于中科院微生物研究所；无菌双蒸水，酶标仪（630 nm）。超净台；微量移液器（100 μL～1000 μL、20 μL～200 μL）；一次性无菌滤膜（0.22 μm）；一次性无菌注射器。

1.3 菌种

德式乳杆菌Lactobacillusdelbrueckii.（ATCC7830）；植物乳酸杆菌Lactobacillus plantarum（ATCC 8014）；鼠李糖乳杆菌 Lactobacillus rhamnosus（ATCC 7469）。

1.4 方法

微生物培养法：某些菌体生长对某种特定维生素具有较强的依赖性。配制选择性的培养基，即含有菌体生长除待测维生素以外的所有营养元素。待测维生素添加的多少直接影响菌体的生长情况。通过添加不同浓度的待检测维生素作为标注曲线，就可以半定量判定样品中的特定维生素的含量，最后通过细菌生长的浊度显示出来。

1.5 前处理

取1 g样品至50 mL离心管中，准确加入双蒸水39 mL，漩涡混匀。在超净台中用0.22 μm无菌滤膜过滤至1.5 mL或2.0 mL无菌试管中。

1.6 培养基制备

加入10 mL无菌水至维生素培养基中，盖好瓶盖，摇匀。在90℃～100℃水浴中加热至少5 min，其间振荡至少2次（保证瓶子封闭），迅速冷却至室温（低于30℃）。使用0.22 μm无菌滤膜过滤培养基至15 mL无菌离心管中。

1.7 标准品配制

VB12、烟酸、叶酸、泛酸、生物素标准品用无菌水配置成不同的浓度梯度，以无菌双蒸水为参比，在630 nm处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，标品浓度为横坐标，绘制标准曲线。

1.8 检测步骤

取出需要数量的微孔板条并在板上固定，未使用的微孔板条立即放回原来的箔袋中，并与干燥剂一起重新封好，储存在2℃～8℃条件下；用移液器吸取150μL待检维生素培养基至微孔中；用移液器吸取150 μL标准品或样品至指定的微孔中；用粘合箔盖住微孔条或微孔；除去粘合箔上的保护层，将其平放在微孔条上，用手或压舌板将粘合箔平压，使其充分封闭微孔板条，保证粘合箔和微孔的封闭性，特别注意微孔的边缘部分；在（37±1）℃黑暗条件下（可用孵育器）孵育20 h～48 h。

1.9 测量及计算

用酶标仪630 nm条件下读取混浊度。使用维生素专用软件进行计算（4P法）。

2 结果

2.1 不同项目样品检测数值统计情况

对泛酸、烟酸、VB12、叶酸、生物素等5种维生素的平均值、标准偏差、RSD和CV值的统计结果见表1。

表1 同一奶粉检测不同项目统计数值Table 1 The statistic value of different item for the same milk power sample

表1结果显示：烟酸和VB12的CV值均为5%，精密度最高。泛酸和叶酸CV值均为7%，精密度紧随其后。生物素的精密度相对较低，CV值为14%。

2.2 不同项目样品检测数值与平均值的偏离情况

对泛酸、烟酸、VB12、叶酸、生物素等5种维生素的平均值进行横向的比较，横线为各检测项目的平均数值。结果见图1～图5。

如图1～图5所示：样品结果成不规则分布，生物素结果分布的较为开阔，总体数值与平均值偏移较大。其余项目结果相对较好。

图1 泛酸检测同一样品散点图Fig.1 The same sample scatterplot of pantothenic acid determination

图2 烟酸检测同一样品散点图Fig.2 The same sample scatterplot of nicotinic acid determination

图3 VB12检测同一样品散点图Fig.3 The same sample scatterplot of vitamin 12 determination

图4 叶酸检测同一样品散点图Fig.4 The same sample scatterplot of folic acid determination

图5 生物素检测同一样品散点图Fig.5 The same sample scatterplot of biotin determination

3 结果与讨论

实验对同一样品不同项目进行30个组份的测试，目的在于观测微生物法检测水溶性维生素的稳定性。结果显示：烟酸、VB12、泛酸、叶酸的CV值均小于10%，符合国标所要求的在重复性条件下获得的2次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。

就样品性质而言烟酸（烟酰胺）性质非常稳定，数据结果重复性很好，CV值为5%。其次VB12的CV值也达到了5%，精密度烟酸和VB12为最好。泛酸和叶酸CV值均为7%，精密度紧随其后，但叶酸相对而言对光较为敏感，操作时要相对注意一些，以防止其见光分解。生物素相对于其他4种而言变化相对较大，CV值为14%。生物素的测定方法众多，微生物法非常灵敏，但由于其他营养物质的影响，所以并非都能达到高准确性[7]。除生物素外，几种维生素检测结果与平均值偏离的范围均比较小。方法重现性和人员的操作过程都在可以接受的范围内。叶酸来源于绿叶蔬菜,缺乏时可引起细胞性贫血和粒细胞减少,尤其对于处于生长发育旺盛期的婴幼儿,如果缺少足够的叶酸,生长就会受到严重影响。孕妇在怀孕期间一般都需要补充叶酸，以防止胎儿畸形的产生。所以叶酸的检测准确性尤为重要。

食品中维生素的测定方法是以仪器分析法为主，但对于少数几种维生素由于其含量甚微，低于仪器的最低检出限，目前仍然依靠微生物法进行测定。但微生物法不易掌握，因此将在测定中积累的一些经验归纳总结，对食品企业或专业实验室的维生素微生物法测定大有裨益。

[1]雷涛，张辉，韩惠雯，等.婴幼儿配方奶粉中水溶性维生素的检测方法研究[J].乳业科学与技术，2004(2):81

[2]中华人民共和国卫生部.GB 5413.15-2010食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中烟酸和烟酰胺的测定[S].北京：中国标准出版社，2010：3-7

[3]中华人民共和国卫生部.GB 5413.17-2010食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中泛酸的测定[S].北京：中国标准出版社，2010：1-4

[4]中华人民共和国卫生部.GB 5413.14-2010食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中维生素B12的测定北京：中国标准出版社，2010：1-4

[5]中华人民共和国卫生部.GB 5413.16-2010食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中叶酸（叶酸盐活性）的测定[S].北京：中国标准出版社，2010：1-6

[6]中华人民共和国卫生部.GB 5413.19-2010食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中游离生物素的测定[S].北京：中国标准出版社，2010：1-4

[7]刁力兰，李秀珍，杨平平，等.生物素测定方法的分析[J].食品与发酵工程，2007，33(6)：107

The Stable Study on Five Water-soluble Vitamin in Milk

LIU Zhi-nan,YU Dong-wei,ZHAO Yuan,LIU Xiao-chuan,LI Mei,ZHAO Ya-li
（Inner Mongolia mengniu dairy industry（group）limited company quality management department analysis test center Huhhot 011500,Inner Mongolia,China）

The microbiological method for assay of vitamin in milk power is the method of the AOAC official requirement,which is also adopted and continued up to now in Chinese national standard.It’s high sensitivity was generally accepted by the world,while the method raise relatively high demand for laboratory and analyst for its complicated operation and much influencing factors.For the question,we made lots of experiments to detect a sample to definite the fluctuation and provide suitable data.Repeated detected the same milk power sample and viewed the value distribution of the sample,the average,the relative standard deviation and the CV.Nicotinic acid,pantothenic acid,folic acid and Vitamin12 possess better stability than biotin;nicotinic acid and pantothenic acid were the best in precision,folic acid and vitamin12 were better than biotin.

microbiological method;nicotinic acid;pantothenic acid;folic acid;Vitamin12;biotin;CV value

刘志楠（1982—），男（蒙），分析研究员，硕士研究生，研究方向：食品检测与分析。

2010-09-25