茶叶、茶鲜叶及茶汤中啶虫脒残留的检测*

苏婷，侯如燕，赵秀霞，钱晓三，杨婷婷

(安徽农业大学茶与食品科技学院，教育部、农业部茶叶生物化学与生物技术重点开放实验室，安徽合肥，230036)

茶叶、茶鲜叶及茶汤中啶虫脒残留的检测*

苏婷，侯如燕，赵秀霞，钱晓三，杨婷婷

(安徽农业大学茶与食品科技学院，教育部、农业部茶叶生物化学与生物技术重点开放实验室，安徽合肥，230036)

建立了茶叶、茶鲜叶、茶汤中的啶虫脒残留量的液相色谱检测方法。茶叶样品经乙腈提取，碱性NaCl饱和溶液萃取，Envi-Carb/NH2固相萃取柱净化，10 mL乙腈洗脱，液相色谱-紫外检测器检测，茶叶，茶鲜叶啶虫脒的添加浓度为0.1～1.0mg/kg时，其平均回收率为68.5% ～103.6.0%，相对标准偏差(RSD)≤13.6%。茶汤啶虫脒的添加浓度为0.033～0.333 mg/L时，其平均回收率为:73% ～103.8%，相对标准偏差(RSD)≤7.6%。用该方法最低检出浓度为分别为:0.07、0.09 mg/kg、0.002 mg/L，符合农药残留分析要求。该方法可用于茶叶中啶虫脒的常规检测和啶虫脒在茶叶生产中应用的安全性评价研究。

啶虫脒，农药残留，高效液相色谱，固相萃取，茶叶

啶虫脒，通用名acetamiprid，是继吡虫啉之后又一种新烟碱类优良杀虫剂，具有广谱、内吸、速效、低毒、活性高、用量少、持效期长等特性［1－3］。由于其作用机理与现有农药不同，对有机磷、氨基甲酸酯以及拟除虫菊酯类农药产生较强抗性的害虫亦有效，能有效防治半翅目和鳞翅目等害虫［4］。3%啶虫脒乳油防治茶小绿叶蝉击倒力强、效果显著［5］。2007年欧盟新公布的茶叶农残限量标准中就新增了啶虫脒残留的限量为 0.1 mg/kg［6－7］，我国尚未制定啶虫脒的MRLs标准。茶叶基质非常复杂，含有大量酚类及生物碱化合物，严重干扰农药残留的检测。楼正云［3］、卢声宇［6］等报道了啶虫脒的气相色谱检测方法。但由于啶虫脒农药极性大，在气相进样口易吸附，因此预试验中表现了重复性差的特点，国内外文献中食品烟碱类农药残留多用液相色谱检测［8－9］，Monika Gupta［10］等报道了液相色谱检测茶叶中啶虫脒的检测方法，但样品前处理方法操作繁琐，使用了二氯甲烷等大量有毒的有机溶剂。因此，本文旨在建立一种简便的茶叶、茶鲜叶及茶汤中啶虫脒残留检测的前处理方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Waters e2695液相色谱仪:配Waters 2489紫外检测器(美国 Waters公司);色谱柱:Phenomenex Gemini C18110A(Φ4.6 mm × 250 mm，5 μm);R-201旋转蒸发器(上海申顺生物科技有限公司);IKA ALL basic组织粉碎机(德国IKA公司);Vortex-2涡旋仪(美国);KQ-250DE超声波清洗器(江苏昆山仪器公司);固相萃取装置(美国 Agilent);Envi-Carb(500 mg，6 mL)、Envi-Carb/LC-NH2(500 mg/500 mg，6 mL)均购自美国Supelco公司;Hitech-kflow超纯水机(Hitech公司)。

啶虫脒标准品(纯度≥98.0%，德国Dr.Ehrensterfer公司);甲醇、乙腈为色谱纯，无水硫酸钠、氢氧化钠、氯化钠(分析纯)，实验用水均为超纯水。

1.2 实验方法

1.2.1 农药标准样品的配制

啶虫脒标样:准确称取固体标准品5.0 mg左右，放入小烧杯加乙腈超声溶解，定容至10 mL，配制500 μg/mL的标准储备液，使用时再根据不同农药在仪器上的灵敏度稀释成不同浓度的标准使用液。

净化用A液(20 mmol/L NaOH-NaCl饱和溶液配制):称取0.8 g NaOH 和360 g NaCl，加适量水溶解后定容至1 000 mL。

1.2.2 样品制备

茶叶样品:取市售茶叶样品，置固体粉碎机中捣碎。对照茶鲜叶样品采摘自安徽农业大学茶叶试验场(未喷施任何农药)，并取部分茶鲜叶按照传统绿茶加工方式制成茶叶。阳性样品为喷施啶虫脒的实验小区采摘的茶鲜叶及其制成的茶叶。阳性样品为喷施过啶虫脒农药的实验小区采摘的茶鲜叶及其制成的茶叶，喷施剂量为(推荐剂量有效成分0.1 g/hm2)推荐采摘间隔期14 d。

1.2.3 样品的提取与净化

提取。茶叶、茶鲜叶:称取茶叶2.0 g，加4 mL水浸泡30 min(茶鲜叶8 g)，加5 g NaCl，再分次加入50 mL乙腈振荡提取，过滤，合并滤液，取40 mL滤液，加入40 mLA液，剧烈振摇静置30 min，萃取分层，取上清液25 mL，旋转蒸干。

净化。加5 mL乙腈预淋洗Carb-NH2柱(上端加1 cm无水Na2SO4)，分次加入少量乙腈，共10 mL溶解上述旋干物，并分次加入Carb-NH2柱，真空抽干，收集全部洗脱液，旋转蒸干。用1mL V(甲醇)∶V(水)=10∶90溶解，待 HPLC检测。

茶汤。称取5 g干茶，加150 mL开水浸泡5 min，过滤待凉后，取出30 mL，加入15 g NaCl，再加入30 mL乙腈剧烈震荡，静置30 min，取上层乙腈层15 mL于圆底烧瓶，旋转蒸干。净化方法与茶叶处理相同。同收集10 mL洗脱液，浓缩至干，1mL V(甲醇)∶V(水)=10∶90待HPLC检测。

1.2.4 液相色谱条件

色谱柱:Phenomenex C18(Φ4.6 mm ×250 mm，5 μm)，流动相:甲醇-水梯度洗脱，初始流动相:甲醇浓度为10%，5 min后梯度升为20%，10 min后升为20%，30 min后40%。流速为1.0 mL/min，检测波长254 nm，柱温 25℃，进样量5 μL。

2 结果与分析

2.1 标准工作曲线制备

用液相色谱-PDA检测器扫描，得啶虫脒的最大吸收波长为254 nm，因此采用254 nm作为HPLC-UV的检测波长，采用外标法标准曲线法定量，以0.05、0.1、0.2、0.5、1.0 μg/mL 浓度的啶虫脒甲醇-水(体积比10∶90)溶液进样，所得的标准曲线回归方程 Y=28.487 X–0.081 3(见图 1)，相关系数 R2=0.999 9。HPLC-UV对啶虫脒的最低检测量为0.01 mg/kg。

2.3 提取溶剂的选择

目前常用的茶叶农药残留提取溶剂有丙酮、乙酸乙酯和乙腈［6］。分别用这3种试剂作提取溶剂来试验提取率(分别做3个平行)，分别取2.0 μg/mL溶解于纯水的啶虫脒标准品置于10 mL各具塞量筒中，加20 mL丙酮、乙酸乙酯、乙腈，各加入5gNaCl，振荡，静置30 min。分别取有机相各10 mL于圆底烧瓶中，旋转蒸干，再用5 mL甲醇定容，HPLC检测，计算3种溶剂的提取回收率分别为:丙酮96.3%，乙酸乙酯95.7%，乙腈98.4%。虽然3种溶剂回收率差异不大，但由于茶叶基质复杂，含有大量的色素、多酚类、生物碱等干扰基质，乙腈因其具有极性强、穿孔透力强、提取效率高、共提物最少的特点。故本研究选用乙腈作为提取溶剂。试验又对比了茶叶在提取前加水浸泡与不加水的提取率，试验表明，不加水直接提取，对样品中啶虫脒的提取率为加水浸泡再提取为29.1%，因此试验选用加水浸泡的再提取的方式。

图1 啶虫脒标准曲线

2.4 净化方法选择

由于茶叶基质与其他食品成分基质相差很大，多酚类和生物碱含量非常高(占茶叶干重的20%～40%)，而这类物质在HPLC-UV紫外检测时均有响应，对茶叶农药残留HPLC分析造成较大影响，选择目前茶叶农药残留分析中常用的Carb柱［6］(填料是石墨炭黑，GCB)，可以除去提取液中的大部分色素，提取液颜色有明显改善，但是对于强紫外吸收的干扰去除效果不明显。用Carb-NH2柱(氨基与石墨炭黑柱串联)净化，由于氨基柱对极性物质的吸附作用，可除去部分有紫外吸收的极性物质(见图2)，在啶虫脒出峰时间25.4～26.2 min时Carb-NH2净化效果较单独使用Carb柱好，但在26 min附近仍有影响啶虫脒检测的干扰物出现，因此仅用Carb-NH2固相萃取方法不能完全去除干扰，使得啶虫脒的检测限偏高，不能满足0.1 mg/kg的欧盟限量标准检测的要求。作者在国家标准研制过程中发现多酚类在碱性条件下可发生离子化［11］，因此乙腈提取液用碱性水溶液萃取时，可除去大部分多酚，因此采用碱性饱和氯化钠溶液萃取乙腈提取液，除去了大量的多酚，取得了满意的净化效果(见图2)，在后续的加标回收实验中也证实了这一点。

2.5 方法添加回收结果

茶叶，茶鲜叶按0.1、0.5、1.0 mg/kg进行方法的添加回收试验(见表1)，结果表明，啶虫脒茶叶中的平均回收率为99.83% ～100.99%，方法的相对标准偏差(RSD)为0.43% ～5.8%;在茶鲜叶中的平均回收率为68.46% ～103.61%，RSD为2.9% ～13.6%。茶汤按0.033、0.167、0.333 mg/L茶汤中添加回收试验(见表2)，回收率为72.95% ～103.75%，RSD为3.5% ～7.6%(空白和加标样品图谱分别见图3～图5)。按添加农药的空白样品检出啶虫脒的峰面积大于基线噪声3倍的量来估算方法的检测限，茶叶、茶鲜叶及茶汤中啶虫脒的检测限分别为:0.07、0.09 mg/kg、0.002 mg/L，均符合残留量的测定要求。

图2 不同净化方法对茶叶空白提取液干扰去除效果对比HPLC色谱图(254 nm)

表1 啶虫脒在干茶和鲜茶3个水平的添加回收率及相对标准偏差(重复3次)

表2 啶虫脒在茶汤中3个水平的添加回收率及相对标准偏差(n=3)

图3 空白茶叶和加标后样品的色谱图

图4 鲜叶空白与加标样品色谱图

图5 茶汤空白与加标样品色谱图

2.6 实际样品分析

取喷药后第14天采摘制成的茶叶、茶鲜叶以及浸泡所得的茶汤检测到啶虫脒的残留量水平在0.2～0.3 mg/kg。

3 结论

建立了茶叶、茶鲜叶和茶汤啶虫脒残留检测的HPLC方法，样品经乙腈提取，碱性氯化钠溶液萃取、Carb-NH2柱净化、乙腈洗脱，较好的去除了复杂的茶叶基质干扰，前处理过程简单，方法只使用了一种前处理溶剂:乙腈，且方法的准确度、精密度满足检测农残检测要求，并且应用此方法检测了实际样品中啶虫脒残留。

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A Method for Determination of Acetamiprid Residue in Tea，Fresh Tea and Tea Infusion with HPLC-UV

Su Ting，Hou Ru-yan，Zhao Xiu-xia，Qian Xiao-san，Yang Ting-ting
(College of Tea＆ Food Sicence and Technology，Key Laboratory of Tea Biochemistry＆Biotechnology，Ministry of Anhui Agricultural University，Hefei 230036，China)

An effective method was developed for analysis of acetamiprid residue in tea，fresh tea and tea infusion by high performance liquid chromatography(HPLC)with UV detector．Tea samples were extracted by acetonitrile and Nacl Alkaline saturated solution，then purified with the Envi－Carb/NH2cartridge，finally eluted with 10ml acetonitrile．Imidcloprid recoveries in tea，fresh tea were in the range of 68．5% ～103．6%with 0．1 ～1．0mg/kg acetamiprid and relative standard deviations(RSD)．when acetamiprid content was 0．033 ～0．333mg/L in infusion，The recovery was 73% ～103．8%with RSD less than 7．6%．Practical determination limit in tea，fresh tea and infusion respectively was 0．07mg/kg，0．09mg/kg and 0．002mg/L．the method is quick and effective．It can be used for routine monitoring of the acetamiprid residues and safety assessment research in the tea．

acetamiprid，pesticide residues，HPLC，solid-phase extraction，tea

硕士研究生(侯如燕为通讯作者，E-mail:hry@ahau．edu．cn)。

*农业部现代农业产业技术体系(农科教发［2008］10号)及张一元科技创新基金项目资助

2011－04－18，改回日期:2011－10－08