VEGF与b-FGF在海水浸泡大鼠烧伤皮肤组织中的表达

张爱群 孙富国 徐忠华 徐振辕 王昭英 陈录庭

现代海战中海水浸泡伤的发生率很高[1]。本研究采用流式细胞仪检测海水浸泡大鼠皮肤烧伤组织中血管内皮生长因子（VEGF）与碱性成纤维细胞生长因子（b-FGF）的表达，探讨两者在病变发展和恢复过程中的作用及意义。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 实验选用普通级SD大鼠60只，雌雄各半，体质量（2.681±8.194）g，随机分成实验组（海水浸泡）和对照组（生理盐水浸泡）。每组又分为损伤后2 h和1、3、5、7、14 d 6个时点，每个时点5只大鼠。

1.2 模型制作 每组大鼠均以10%水合氯醛0.7～0.8 mL腹腔内注射，麻醉后1～2 min即实施模型制作。鼠背部褪毛并用酒精灯蓝色火焰烧灼局部皮肤7～8 s，造成深Ⅱ度烧伤（病理证实），面积约3 cm×3 cm×4 cm，然后将大鼠分别浸泡于海水或生理盐水中，2 h后取出，大鼠可自由摄食和饮水。

1.3 标本采集 分别于浸泡后2 h和1、3、5、7、14 d脱颈处死，取烧伤处皮肤组织，70%乙醇固定，4℃冰箱封存约30 d。

1.4 实验方法

1.4.1 流式细胞仪及检测参数 采用美国Beckman Coultet公司生产的Epics-XLⅡ型流式细胞仪，激发光源为15 mW氩离子激光器，激光波长为488 nm。

1.4.2 主要试剂 美国圣克鲁斯生物公司生产VEGF鼠抗人多克隆抗体（147）：SC-507；b-FGF鼠抗人多克隆抗体（147）：SC-79。

1.4.3 流式细胞悬液制备方法 将固定的组织放在120目不锈钢网上下置一平皿，用眼科剪刀将组织剪碎，用眼科镊子轻轻搓组织块，边搓边用生理盐水冲洗，直至将组织搓完为止。将平皿中的混悬液经300目铜网过滤去除细胞团块，收集细胞悬液，以500～800 r/min离心沉淀2 min。

1.4.4 细胞免疫荧光标记 取单细胞悬液1×106/mL 0.1 mL，加入鼠抗人多克隆抗体工作液0.1 mL，室温孵育30 min，加入PBS 10 mL洗涤1次，弃上清，加入羊抗鼠荧光素-IgG（FITC-IgG）二抗工作液100 μL，避光、室温孵育30 min，加入PBS 10 mL离心同上，弃上清以除去未结合的荧光抗体，上机检测前加入二抗的阳性对照和阴性对照。

1.5 统计学分析 应用SPSS 12.0统计软件,计量资料以±s表示，同一时点组间比较采用两独立样本资料t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2组大鼠皮肤烧伤组织伤后1～14 d，实验组VGEF和b-FGF表达均高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01），见表1。

3 讨论

VEGF与b-FGF是皮肤烧伤创面愈合过程中的2种重要细胞因子。对创面血管增生、肉芽组织形成、胶原纤维合成有重要作用。海水具有高渗、碱性、低温、有菌等特点，可加重伤口局部及周围组织的水肿、变性、坏死及炎性反应[2]。海水浸泡伤口，受海水高渗等理化因素的影响，使局部组织微环境及各种生长因子发生变化，导致VEGF与b-FGF升高，两者与组织创伤的严重程度及愈合情况关系密切。

VEGF是一种特异性作用于血管内皮细胞的多功能细胞因子，广泛表达于成纤维细胞、平滑肌细胞、内皮细胞及肿瘤细胞等多种细胞，VEGF特异地与血管内皮细胞上的专一受体血管内皮生长因子受体Ⅰ（FLR-1）或血管内皮生长因子受体Ⅱ（KDR）结合，从而引起内皮细胞增殖及血管通透性增加，其主要功能是促进血管内皮细胞分化增殖，增加微静脉和小静脉的通透性[3]，使血浆蛋白渗到血管外形成临时基质，利于血管形成[4]，在皮肤损伤愈合过程中起重要作用。正常皮肤有多种细胞因子表达，其中VEGF呈低水平表达，主要表达于基底细胞及血管内皮细胞。VEGF的表达受低氧、活化癌基因、生长因子、细胞因子等多种因素的调控[5]，如b-FGF、肿瘤坏死因子（TNF）-α等均可促进VEGF的表达，间接发挥促血管形成的作用。本研究显示VEGF自损伤后2 h开始升高，损伤后1～14 d实验组高于对照组，损伤后5d达高峰，较对照组峰值错后2 d，以后缓慢下降，但仍高于对照组。随损伤创面的愈合，VEGF逐渐下降，实验组明显慢于对照组，VEGF在形成新生血管的同时，也加重组织细胞的脱水，使血栓形成的危险增加。b-FGF即碱性成纤维细胞生长因子，可诱导多种细胞增殖、分化，与创伤愈合密不可分。b-FGF可促进VEGF的生成，发挥促血管生成作用，且具有丝裂原活性，可促进成纤维细胞的生长、增殖，其还具有趋化作用，趋化炎性细胞和组织修复细胞向创面聚集[6]。b-FGF主要存在于表皮细胞、内皮细胞和部分成纤维细胞的胞浆和胞外基质中。对伤口肉芽组织形成、局部血管增生、胶原纤维合成有重要作用，与海水浸泡伤情严重程度有关。

表1 VEGF与b-FGF在海水浸泡大鼠皮肤织中不同时间的表达 （n=5，±s）

表1 VEGF与b-FGF在海水浸泡大鼠皮肤织中不同时间的表达 （n=5，±s）

*P＜0.05，**P＜0.01

指标 组别VEGF b-FGF对照组实验组t对照组实验组t 2 h 320.42±40.51 338.89±52.97 0.619 338.38±26.56 395.76±98.17 1.262 1 d 332.05±40.23 397.99±33.16 2.828*389.71±41.38 490.64±66.76 2.874*损伤后时间3 d 414.07±65.19 492.27±34.01 2.378*434.04±29.75 522.66±31.52 4.572**5 d 411.33±33.44 529.49±41.16 4.982**441.20±21.54 534.05±33.90 5.170**7 d 405.44±52.00 498.38±49.09 2.906*434.04±35.56 569.39±53.51 4.711**14 d 349.89±38.20 421.18±49.49 2.550*411.24±19.89 483.68±53.76 2.826*

VEGF与b-FGF在海水浸泡大鼠皮肤烧伤局部组织表达增高，与细胞缺血、缺氧、损伤程度及范围有密切关系，对判断海水浸泡伤情及预后具有一定参考价值，临床救治过程中应密切注意血液浓缩等情况的改变，防止血栓形成的发生。

[1]沈宏亮,王强,钱方,等.左氧氟沙星壳聚糖缓释微球对海水浸泡创伤的初期治疗效果[J].外科理论与实践,2006,31（3）:262-264.

[2]蒋建新,王正国,尹志勇.战创伤研究进展[J].人民军医,2007,50（1）:22-24.

[3]李菲菲,米立国,隋鸿锦.血管内皮生长因子对皮肤血管生成影响的研究进展[J].大连医科大学学报，2009,31（5）：599-603.

[4]刘霞,高峰.创伤愈合的分子机制研究进展[J].医学综述，2005，11（3）:199-202.

[5]毛光华，韩存芝，张俊萍，等.血清中VEGF，VEGFR1与VEGFR2在肺癌中的表达及其相互关系[J].中国现代药物应用，2009,3（22）：1-2.