附子多糖预防高胆固醇血症的作用及其对肝脏CYP7α-1表达的影响*

周 芹， 段晓云， 陆立鹤， 肖 颖， 黄雄庆△， 吴伟康

(中山大学1附属第一医院麻醉科,2中山医学院病理生理教研室，广东 广州 510080)

附子多糖预防高胆固醇血症的作用及其对肝脏CYP7α-1表达的影响*

周 芹1， 段晓云1， 陆立鹤2， 肖 颖1， 黄雄庆1△， 吴伟康2

(中山大学1附属第一医院麻醉科,2中山医学院病理生理教研室，广东 广州 510080)

目的： 探讨附子多糖(FPS)预防高胆固醇血症的作用及其对肝脏胆固醇7α-羟化酶(CYP7α-1)表达的影响。方法SPF级雄性Wistar大鼠50只，体重100 g，随机分为正常组(control)、高胆固醇组(HC)和HC+附子多糖(HC+FPS)低、中、高3个剂量组，每组10只，分别给予正常、高胆固醇及高胆固醇加附子多糖(224、448和896mg·kg-1·d-1)饮食，持续2周，检测各组的血脂水平；观察control组、HC组和HC+FPS(224 mg·kg-1·d-1)组大鼠的体重、进食量和粪便量的变化，实验结束后取3组大鼠的肝脏行HE染色；并检测3组大鼠肝脏羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶mRNA水平、CYP7α-1 mRNA和蛋白水平以及粪便总胆汁酸含量等方面的改变。结果附子多糖能显著抑制高胆固醇血症大鼠血清中总胆固醇(TC)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的水平(Plt;0.05)；HC+FPS组大鼠肝细胞脂肪变性较HC组轻微；real-time PCR和Western blotting结果显示附子多糖能显著上调高胆固醇大鼠肝脏CYP7α-1 mRNA水平和蛋白表达并明显降低HMG-CoA还原酶的mRNA水平(Plt;0.01)；HC组大鼠粪便中胆汁酸的含量增多而HC+FPS组进一步增加(Plt;0.05)。结论附子多糖具有明显的降血胆固醇作用，其机制与上调CYP7α-1 mRNA及蛋白水平和下调大鼠肝脏HMG-CoA还原酶mRNA水平有关。

附子多糖; 高胆固醇血症; 胆固醇 7α-羟化酶; 羟甲基戊二酰辅酶A还原酶

高脂血症是指血浆或血清中一种或多种脂质(主要指胆固醇和甘油三酯)的含量超过正常高限时的病症。早在1975年Keys[1]就发现血浆中胆固醇和低密度脂蛋白浓度的增高将明显增加动脉粥样硬化性疾病的发生率，而冠心病的死亡率与血脂胆固醇水平也呈正相关关系[2]。目前市场上降胆固醇的西药大多价格昂贵且都存在一定的不良反应[3,4]，近年来中草药的降脂作用得到了大家广泛的重视和应用[5,6]。本实验室成功从四逆汤的主药附子中提取了水溶性好、无毒的葡聚糖成分附子多糖(Aconitituber polysaccharides,Fuzi polysaccharides,FPS)，并申请了专利[7]；对它的系列研究表明其具有免疫调节、降血糖、抗心衰以及肝细胞胀亡等作用[8,9]。本研究深入探讨其预防大鼠高胆固醇血症的作用及机制。

材 料 和 方 法

1材料

1.1附子多糖 由中山大学病理生理实验室提取并申请专利(专利号200610034083.1)。

1.2饲料 高胆固醇饮食配方为2％胆固醇，0.5％胆酸盐与基础饲料混合。

1.3主要试剂和仪器 3700M071型代谢笼购自Tecniplast；总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白试剂盒购于上海荣盛生物技术公司； Trizol reagent购自Invitrogen，SYBR Green I荧光染料购于Roch，其它主要试剂购于Fermentas；兔抗鼠胆固醇7α-羟化酶(cholesterol 7α-hydroxylase,CYP7α-1)抗体和辣根过氧化物共轭的羊抗兔的Ⅱ抗购于Santa Cruz。

1.4动物分组和饲养 SPF级健康雄性Wistar大鼠50只，6-8周龄，体重(100±13)g，于中山大学北校区动物中心饲养，合格证号为SCXK(粤)2004-0011。适应性饲养1周后随机分为5组：正常组(control)、高胆固醇组(high-cholesterol diet,HC)和附子多糖低、中、高剂量组，每组10只，采用代谢笼单笼单只喂养。正常组饲喂基础饲料，高胆固醇组和附子多糖组饲喂高胆固醇饮食，其中附子多糖低、中、高组分别按224、448和896 mg·kg-1·d-1灌胃附子多糖生理盐水溶液10 mL·kg-1；正常组和高胆固醇组灌服等体积生理盐水，给予自由饮水，实验持续2周。于第14 d晚上撤去食物但不禁水，第2 d早上8时给予戊巴比妥钠40 mg·kg-1腹腔注射麻醉后摘除眼球取血1 mL，血液标本于1 500 r·min-1，离心15 min，分离血清。每天精确计算正常组、高胆固醇组及附子多糖(224 mg·kg-1·d-1)组中每只大鼠的进食量、粪便量并每隔2 d称重1次。最后处死动物并迅速取出肝脏用生理盐水洗净滤纸吸干后分成2份，1份立即放入10％甲醛中固定，石蜡包埋;另1份立即液氮冷冻后放入-80℃冰箱保存备用。

2测定指标及方法

2.1血脂测定 总胆固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、高密度脂蛋白 (high-density lipoprotein,HDL)用上海荣盛生物技术公司试剂盒测定。

2.2大鼠肝脏的HE染色 将石蜡包埋的大鼠肝脏标本进行常规HE染色。

2.3大鼠肝脏组织的实时定量聚合酶链反应(realtime PCR) 提取总RNA后进行洗涤和浓度测定，将总RNA和引物合成cDNA，最后用SYBR Green荧光染料法定量PCR，其中选择的引物结果及相关条件如下：

羟甲基戊二酰辅酶A(hydroxymethylglutaryl coenzyme A,HMG-CoA)还原酶上游引物5’-CTT GAC GCT CTG GTG GAA TG-3’，下游引物5’-AGT TGG AAG CAC GGA CATA -3’，扩增片段106 bp；反应参数为:94 ℃预变性3 min；94 ℃60 s，55 ℃45 s， 10个循环。

CYP7α-1上游引物 5’-ATG ACC TGC CGG TAC TAG ACA-3’，下游引物5’-TGA AGT CCT CCT TAG CTG TGC-3’，扩增片段90 bp；反应参数为:94 ℃ 45 s，55 ℃ 30 s，30个循环。

2.4大鼠肝脏CYP7α-1蛋白检测 提取大鼠肝脏细胞膜蛋白后使用核酸蛋白测定仪测定提取的蛋白浓度；分别配、灌制10％分离胶和5％积层胶并进行SDS-PAGE电泳，其后转移到硝酸纤维素膜，加入1∶800浓度TBS/T稀释的CYP7α-1抗体孵育(4 ℃摇床轻摇过夜)，与辣根过氧化物共轭的驴抗山羊Ⅱ抗(1∶2 000)进行抗原抗体反应，最后进行显影、检测。

2.5粪便总胆汁酸的测定 实验结束前3 d，代谢笼收集大鼠粪便称重之后保存，收集72 h粪便 ，56 ℃烘干至试样恒重为止。每只大鼠均随机取试样50 mg，参照文献[10]的方法进行测定，并根据实验操作过程试剂的配制及大鼠的排粪量折算成72 h大鼠粪便排出胆汁酸的总量。

3统计学处理

结 果

1大鼠的血脂变化

HC组大鼠的血清胆固醇和低密度脂蛋白较对照组明显增加(Plt;0.05)。而HC+FPS各组均能显著抑制高胆固醇饮食导致的血清总胆固醇和低密度脂蛋白升高(Plt;0.05)；而对甘油三酯和高密度脂蛋白无显著影响，见表1。

表1 FPS不同剂量组对血脂的影响

2附子多糖对大鼠进食量、粪便量和体重的影响

各组大鼠间的体重、摄食量及粪便排出量均无显著差异，提示FPS对大鼠的体重、摄食量和粪便排泄量均无影响。

3大鼠肝脏组织HE染色

光学显微镜下可见：HC组大鼠的肝脏细胞脂肪变性改变较为明显，而HC+FPS组改变较HC组轻微,见图1。

Figure 1.Pathological changes of liver(HE staining,×400) .A:control;B:HC;C:HC+FPS(224 mg·kg-1·d-1).

4肝脏HMG-CoA还原酶mRNA水平

HC组中肝脏HMG-CoA还原酶的mRNA水平较对照组明显增加(Plt;0.01)；HC+FPS组比HC组明显下降(Plt;0.01)而与对照组无显著差异，见表2。

5肝脏CYP7α-1的mRNA水平和蛋白表达

与HC组相比，HC+FPS组CYP7 α-1 mRNA和蛋白表达均明显升高(Plt;0.01)；HC组与对照组比无显著差异，见表2、图2。

表2 FPS对大鼠CYP7α-1和HMG-CoA还原酶 mRNA表达的影响

Figure 2.Effect of FPS on hepatic CYP7α-1 protein expression in rats determined by Western blotting.±s.n=10.**Plt;0.01 vs HC.

6粪便总胆汁酸的测定结果

HC组大鼠的粪便中胆汁酸的含量明显增多，而HC+FPS组能进一步增加粪便中胆汁酸的含量(Plt;0.05),见图3。

Figure 3.Effect of FPS on fecal bile acid content in the last threedays of the study period±s.n=10.#Plt;0.05 vs control;*Plt;0.05 vs HC.

讨 论

四逆汤是医圣张仲景《伤寒论》中所创经典名方，以回阳救逆的功效而著名。本课题组的前期研究发现四逆汤具有减轻家兔动脉粥样硬化，降低血脂的作用[11,12]。方中君药附子，始载于《神农本草经》，为毛莨科多年生草本植物乌头子根的加工品,在心血管、消化、神经、内分泌等方面都具有重要的药理作用。本研究发现FPS在224 mg·kg-1·d-1这个剂量已经明显抑制饲喂高胆固醇饮食大鼠血清TC和LDL-C水平的升高。本课题组前期对小鼠的研究提示：FPS(160 mg·kg-1·d-1)2周能显著抑制高脂饮食导致的血清甘油三酯、胆固醇和低密度脂蛋白的升高，且降血清胆固醇和低密度脂蛋白的作用与氟伐他汀相当；本实验中FPS 224 mg·kg-1·d-1的剂量与FPS 160 mg·kg-1·d-1剂量相当，其降胆固醇效应也与前期实验结果相一致。

本实验采用3700M071型代谢笼单笼单养，喂食、饮水以及粪便、尿液的收集互不干扰，保证了数据的准确性。对照组、HC组、HC+FPS(224 mg·kg-1·d-1)组大鼠的摄食量、粪便排泄量及体重的增长均无显著差异，证明FPS引起TC和LDL-C的水平下降与食欲、进食及排泄无关。肝组织HE染色可见HC组大鼠的肝脏细胞脂肪变性改变明显，而HC+FPS组已有明显好转。

内源性胆固醇合成是一个极其复杂的过程，肝脏是其合成的主要场所。其中HMG-CoA还原酶是一个关键的限速酶，其浓度高低直接影响胆固醇合成的数量。本研究结果显示：FPS抑制HMG-CoA 还原酶mRNA表达，表明FPS可通过抑制HMG-CoA还原酶而使内源性胆固醇合成减少，与他汀类降脂药的作用类似[13,14]。

大量研究表明胆固醇在肝脏中转化为胆汁酸是其主要去路。CYP7α-1起着关键作用,其数量或者活性增加可以加快肝细胞内的胆固醇转换成胆汁酸[15]；因此，测定CYP7α-1的水平以及粪便中胆汁酸的含量有助于了解机体胆固醇代谢的情况。实验结果显示：HC+FPS组CYP7α-1 mRNA的表达和蛋白水平均显著增加；粪便总胆汁酸的排出亦显著增加。提示FPS能够增强CYP7α-1的转录和翻译水平，加快肝细胞内的胆固醇转换成胆汁酸；而且能增加粪便中胆汁酸的排出，最终使体内过多的胆固醇排出体外。

本研究提示：FPS具有明显的降血胆固醇作用，其机制与FPS增加CYP7α-1的基因转录和蛋白表达有关，从而促进了体内胆固醇转化为胆汁酸，随粪便排出体外；同时FPS还能抑制HMG-CoA还原酶mRNA表达，抑制内源性胆固醇合成，使血中胆固醇浓度下降。由于FPS明确的降脂和免疫调节作用，几乎无任何毒、副作用，极有可能成为抗动脉粥样硬化性疾病的理想药物。

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在成骨细胞分化过程中调节Osterix转录因子表达和肿瘤坏死因子

活性的同源异形盒蛋白Prx1的表达

肿瘤坏死因子 (TNF-α)具有促使骨质疏松发生和抑制骨形成的作用，是骨节炎症中导致骨骼损伤的重要因子。成骨细胞(osteoblast,OB)来源于多能间充质细胞系，是骨形成的主要功能细胞，其按一定的路径分化为成熟骨细胞。Osterix(Osx,SP7)是一种OB分化所必需的转录因子。有实验证明如果机体缺乏该转录因子会导致骨骼软骨化。美国科学家的研究曾经报道过一种位于Osx启动子内的TNF抑制元件，这种抑制元件可以用于分离核蛋白，从而介导TNF-α发挥抑制OB分化的作用。用TNF-α处理前成骨细胞，然后将该细胞中的核提取物与TNF抑制元件共同培养进行蛋白pull-down实验，之后通过质谱分析法检测分析获得的胰蛋白酶片段。利用染色质免疫共沉淀法证实出8种结合转录因子的存在。PCR结果显示，同源异形盒蛋白(homeobox protein，Prx1)在原始基质细胞(即间充质干细胞，MSCs)、C3H10T1/2细胞和MC3T3前成骨细胞中表达。以前的研究已确认Prx1是一种在胚胎肢芽形成和骨骼塑型中起重要作用的蛋白。TNF-α可以促使Prx1表达过程中转录形成的mRNA数量增长14倍，同时它还加速Prx1在MC3T3细胞胞浆和胞核内积聚以及在体内骨膜内层细胞和小梁内层细胞内表达。Prx1瞬间表达抑制了Osx和RUNX2基因的转录，其同源异构体Prx1b即Prx2的表达降低了Osx和RUNX2 mRNA的形成，也抑制了成骨细胞的分化。在对Prx1特异的小干扰RNA(siRNA)作用下Prx1表达沉默，消除了TNF-α对Osx mRNA的抑制作用，从而加速Osx的基础表达。经电泳迁移率检测显示Prx1b是首选的与Osx启动子结合的蛋白。以上研究结果证实，Prx1是参与TNF-α抑制Osx表达和成骨祖细胞分化的固有介质。TNF-α激活Prx1，从而抑制关节炎、女性更年期和衰老等情况下骨的形成。

J Bone Mineral Res,2011,26(1):209-219 (李丽娜)

EffectsofAconitituberpolysaccharidesonhypercholesterolemiaandhepaticcholesterol7α-hydroxylaseexpressioninrats

ZHOU Qin1,DUAN Xiao-yun1,LU Li-he2,XIAO Ying1,HUANG Xiong-qing1,WU Wei-kang2

(1DepartmentofAnesthesiology,TheFirstAffiliatedHospital,2DepartmentofPathophysiology,ZhongshanSchoolofMedicine,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China.E-mail:hxiongqing@21cn.com)

AIM: To investigate the effects of polysaccharides isolated fromAconitituber (Fuzi polysaccharides,FPS) on the prevention of hypercholesterolemia induced by high-cholesterol diet and the expression of hepatic cholesterol 7α-hydroxylase (cytochrome P450 7α-1,CYP7α-1) in rats.METHODSFifty male Wistar rats were randomly divided into 3 groups.The rats were fed with normal diet (control group),high-cholesterol diet (HC group) or high-cholesterol diet plus FPS (224,448 or 896 mg·kg-1·d-1,FPS group) for 2 weeks.The serum lipid level,body weight,food-intake and fecal amount were measured at week 2.The pathological changes of the liver were observed with HE staining.The mRNA expression of hydroxy methylglutaryl coenzyme A (HMG-CoA) reductase and CYP7α-1,the protein level of CYP7α-1,and fecal bile acid were also detected at week 2.RESULTSFPS significantly inhibited high-cholesterol diet-induced elevation of serum total cholesterol (TC) and low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C) (Plt;0.05).HE staining showed that FPS attenuated fatty degeneration in liver.Real-time PCR analysis showed that FPS significantly up-regulated the mRNA expression of CYP7α-1,but down-regulated the mRNA expression of HMG-CoA reductase (Plt;0.01).The protein level of CYP7α-1 was higher in FPS group than that in HC group (Plt;0.01).The level of fecal bile acid in HC-treated rats was higher than that in the control rats,and FPS stimulated the excretion of fecal bile acid (Plt;0.05).CONCLUSIONFPS significantly reduces serum cholesterol levels,which is associated with the up-regulation of hepatic CYP7α-1 expression and down-regulation of hepatic HMG-CoA reductase expression.

Aconitituber polysaccharides; Hypercholesterolemia; Cholesterol 7α-hydroxylase; Hydroxymethylglutaryl CoA reductases

1000-4718(2011)05-0991-05

R287

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.05.030

2011-01-01

2011-03-28

国家自然科学基金资助项目(No.30070930)

△通讯作者 Tel:020-87755766-8273；E-mail:hxiongqing@21cn.com