胎盘ABCB4表达下调对胆汁酸排泌功能的负性调节作用及其对围生儿预后的影响

陈新萍, 张 智, 刘丝荪

(南昌大学医学院第一附属医院妇产科，江西 南昌 330006)

胎盘ABCB4表达下调对胆汁酸排泌功能的负性调节作用及其对围生儿预后的影响

陈新萍△, 张 智, 刘丝荪

(南昌大学医学院第一附属医院妇产科，江西 南昌 330006)

目的： 研究妊娠期肝内胆汁淤积症(ICP)患者胎盘ABCB4表达下调对胎儿胆汁酸排泌代谢的影响及其与胎儿围生期预后的关系。方法采用RT-PCR和免疫组化技术检测妊娠晚期ICP患者(30例，ICP组)和正常晚孕妇女(30例，对照组)胎盘组织中ABCB4 mRNA和蛋白的表达情况，采用化学氧化法和酶动力学法检测母血胆红素及转氨酶，采用放射免疫分析方法检测母血及脐血中的甘氨胆酸(GA)含量，并与胎儿围生期预后进行相关性分析。结果对照组胎儿围生期预后明显好于ICP组，其新生儿体重和Apgar评分均高于ICP组(Plt;0.01)，而羊水粪染率低于ICP组(Plt;0.01)。两组胎盘组织中均检测到ABCB4 mRNA和蛋白的表达，但与对照组相比，ICP组胎盘组织ABCB4 mRNA和蛋白均明显降低(Plt;0.01)。ICP组母血中丙氨酸转氨酶、总胆红素以及母血、脐血中GA水平均高于对照组(Plt;0.01)，而且，脐血GA、母血GA水平与ABCB4 mRNA呈明显负相关(r=-0.627；r=-0.795，均Plt;0.01)。结论胎盘ABCB4表达下调对胎盘胆汁酸的排泌功能有负性调节作用，这可能是引起ICP围生儿预后不良的重要机制之一。

妊娠期肝内胆汁淤积症； 胎盘； 甘氨胆酸； ABCB4

妊娠期肝内胆汁淤积症(intrahepatic cholestasis of pregnancy，ICP)是一种发生在妊娠中、晚期的常见病。ICP对母体无严重危害，但为胎儿窘迫、早产、羊水粪染、死胎和死产的主要原因之一[1,2]。ICP病因及发病机制研究多集中在母体方面：认为ICP的发生与母体肝脏胆淤相关基因如ABCB4基因(P-glycoprotein gene)的异常表达有密切关系，但有关胆淤相关基因在胎盘组织的研究较少。鉴于ICP对母体影响甚微而对胎儿危害严重的特点以及肝细胞与胎盘合体滋养细胞在结构和功能方面的相似性，我们从胎儿和胎盘组织胆汁酸代谢的角度，研究ICP患者胎盘组织ABCB4表达对胎儿胆汁酸代谢的影响及其对胎儿的危害。

材 料 和 方 法

1研究对象

2008年9月至2009年6月南昌大学第一附属医院的剖宫产病例60例。对照组30例：正常足月分娩妊娠妇女，平素月经规则，末次月经确切，年龄在20-38岁，均为单胎，无高血压、糖尿病、心脏病和肝肾疾病史，无其它妊娠合并症和并发症；ICP组30例：按2008年《中华妇产科学》诊断标准诊断为ICP[1]，年龄为22-36岁，均于孕34-39周行剖宫产终止妊娠，孕前3个月或孕期服用过避孕药或其它药物、妊娠期有急慢性全身疾病、肝胆病史或自身免疫性疾病、有其它妊娠并发症及合并症或不能用ICP解释的血、尿生化异常不纳入本组实验。所有实验均通过医院伦理委员会同意。

2方法

2.1标本收集 两组孕妇胎盘娩出后，从母面中央取材，取胎盘组织块约1 cm×1 cm×1 cm，10％甲醛固定，另取一部分置液氮保存。按常规方法测量新生儿身长、体重，准确称量胎盘重量和新生儿Apgar评分。根据羊水性状分为0°-Ⅲ°,0°羊水清;Ⅰ°呈淡黄色;Ⅱ°呈黄绿色;Ⅲ°呈棕黄色黏稠。Ⅰ°改变为轻度污染，Ⅱ°-Ⅲ°为重度污染。血标本收集：(1)母体外周血：剖宫产术前在无菌条件下抽取对照组及ICP组孕妇空腹肘静脉血各2管(3 mL/管)，一管送同位素室，置于2-8℃低温冰箱保存统一待测；一管肝素抗凝送生化室进行丙氨酸转氨酶(alanine transaminase，ALT)及总胆红素(total bilirubin,TBIL)的测定；(2)脐血标本采集：新生儿断脐后，采集脐静脉血2 mL置于干燥管，送同位素室，置于2-8 ℃低温冰箱保存待测。

2.2孕妇肘静脉血与胎儿脐静脉血甘氨胆酸(glycocholic acid， GA)测定及孕妇肝功能测定 采用竞争性放射免疫分析法、酶动力学方法及化学氧化法检测孕妇肘静脉血与胎儿脐静脉血GA和孕妇肝功能。GC-911 γ放射免疫计数仪由中国科大创新股份有限公司制造，试剂盒由北京中科院提供，实验按试剂盒提供的步骤进行。参考正常值：空腹血清GA含量为(1.14±0.57)mg/L；空腹ALT:lt;40U/L；TBIL：1.71-17.10 mmol/L。

2.3胎盘组织ABCB4 mRNA测定 RT-PCR法行胎盘组织ABCB4 mRNA测定。在无菌试管内将-80 ℃冷冻的胎盘组织用生理盐水洗涤至无血色，剪刀将其剪碎后放入匀浆器内撵成匀浆提取总RNA。总RNA提取试剂 Biozol和BioRT逆转录扩增(RT-PCR)试剂盒均购自杭州博日科技有限公司。ABCB4片段长度312 bp，RT-PCR扩增上游引物5’- CTGCTGGAAAGATTGCAACAG-3’，下游引物5’-GAG CAA ATG AAC TCG CAT GTC-3’；内参照β-actin 长度521 bp，上游引物5’-CAC ACT GTG CCC ATC TAC GA-3’，下游引物5’-TCA GGA GGA GCA ATG ATC TTG-3’。PCR反应体系：10×PCR buffer 2.5 μL，dNTP mixture 0.5 μL，10×PCR buffer 0.5 μL，上游引物和下游引物各0.5 μL，Taq mix DNA polymerase 2.5 μL，cDNA18 μL加水至25 μL。PCR反应条件：94 ℃ 3 min,94 ℃ 30 s,50 ℃ 30 s,72 ℃ 2 min，35个循环。PCR产物常规行琼脂糖凝胶电泳，采用面积吸光度值半定量分析测定胎盘组织中ABCB4 mRNA灰度值，与相应的β-actin灰度值相比，得出ABCB4 mRNA相对量。

2.4ABCB4蛋白在胎盘组织的表达 采用免疫组织化学方法检测胎盘组织ABCB4蛋白表达。3-4 mm胎盘组织石蜡切片常规脱蜡至水，0.01 mol/L柠檬酸钠缓冲液(pH 6.0)于微波炉(高火煮沸6 min，中火20 min)修复抗原后，组织切片自然晾至室温。3％H2O2室温孵育10 min，封闭内源性过氧化物酶。PBS洗3次，5 min/次。抗ABCB4单抗(1∶10稀释，艾碧康生物制品有限公司)孵育2 h。PBS洗 3次，5 min/次。中杉金桥Ⅱ抗室温孵育30 min。PBS洗3次，5 min/次。DAB显色10 min。苏木素复染后，脱水，透明，中性树胶封片，观察结果。

3统计学处理

结 果

12组一般情况和围生儿预后比较

ICP组与对照组孕妇平均年龄、孕次及产次无显著差异(Pgt;0.05)，孕周差异显著(Plt;0.01)，两组母血ALT及ABIL显著差异(Plt;0.01)。对照组新生儿体重和Apgar评分均高于ICP组，差异显著(Plt;0.01)；对照组胎盘重量高于ICP组，差异显著(Plt;0.05)；ICP组羊水粪染率高于对照组，差异显著(Plt;0.01),见表1。

表1 ICP组与对照组孕妇一般情况、新生儿体重、Apgar评分、胎盘重量和羊水粪染的比较

2母血、脐血GA水平比较

ICP组母血血清GA为(26.86±8.51)mg/L，与对照组[(2.70±2.19)mg/L]相比差异显著(Plt;0.01)。ICP组中脐血GA(19.97±8.80)mg/L,与对照组[(5.83±5.06)mg/L]相比显著差异(Plt;0.01)，ICP组母血与脐血血清GA水平呈显著正相关(r=0.588，Plt;0.01)，但对照组母血与脐血血清GA水平无相关关系(r=0.212，Pgt;0.05),见表2。

表2 ICP患者和正常孕妇母血、脐血GA相关性分析

3胎盘组织ABCB4mRNA和ABCB4蛋白的表达

在ICP组及正常晚孕组胎盘组织中均检测到ABCB 4 mRNA，见图1，与正常妊娠组相比，ICP组胎盘组织中ABCB4 mRNA的水平下降(Plt;0.01),而且，ABCB4 mRNA相对量与脐血GA和母血GA均呈负相关，其相关系数分别为r=-0.627(Plt;0.01)和r=-0.795(Plt;0.01)，见表3。免疫组化显示ABCB4蛋白在ICP胎盘中的定位和正常胎盘组织中分布基本一致，均分布于合体滋养细胞的细胞膜上，但是在正常妊娠胎盘组织中棕黄色颗粒颜色深,ICP胎盘组织棕黄色颗粒颜色较浅,见图2。

Figure 1.RT-PCR analysis of ABCB4(312 bp) and β-actin(521 bp) mRNA expression.Lane 1,2: ICP group；Lane 3,4:control group.

表3 两组胎盘ABCB4 mRNA相对量与母血、脐血GA相关性分析

Figure 2.Expression of ABCB4 protein in placenta tissues(immunohistochemical staining,×400).A:control group;B:ICP group.

讨 论

母胎间胆汁酸经胎盘的转运是妊娠期胎儿胆汁酸代谢的关键，胎儿血中胆汁酸必须首先通过载体蛋白经合体滋养细胞基底膜摄入合体滋养细胞，再通过滋养细胞母体侧依赖转运蛋白排出滋养细胞进入母体血液。生理妊娠情况下，胎儿胆汁酸水平高于母血中的水平，母胎间的胆汁酸浓度差有利于胎儿胆汁酸通过胎盘由母体排泄，使母胎胆汁酸处于动态平衡[3]。ICP时，由于母体胆汁淤积，母体肝细胞内的胆汁酸蓄积并逆流入体循环，母血胆汁酸水平升高，使得母胎间的胆汁酸浓度梯度不存在，胎盘的胆汁酸转运系统可能同时受到损害，导致胎儿胆汁酸淤积[4]。本研究结果表明ICP组母血及脐血胆汁酸水平均明显升高，且呈正相关，佐证了胎盘胆汁酸排泌功能受损可加重母胎高胆汁酸血症对胎儿的危害[9]。

胎盘对胆汁酸的排泌与ABCB4蛋白有密切关系[5]。ABCB4蛋白是一种重要的载体蛋白，其基因定位于染色体7q21.1[6]，编码产物即ABCB4蛋白，又名多药耐药蛋白，属于p型糖蛋白(P-gp)超基因家族，其主要分布于肝脏毛细胆管膜，是肝脏毛细胆管膜磷脂输出泵，能有效地转运磷脂进入毛细胆管，在毛细胆管内胆盐与磷脂可形成微胶粒，从而保护胆管细胞免受胆盐损伤。肝细胞具有膜极性，由生化结构和生物功能均不同的基底膜(血窦面)和毛细胆管膜(肝内胆管面)组成，而胎盘合体滋养细胞也和肝细胞有着相似的结构，基底膜(胎儿面)和游离缘(母体面)质膜，并且同样存在着相应的载体蛋白[7]。在本实验中，我们发现影响胆汁酸代谢的ABCB4基因在胎盘组织中有着一定的表达。与正常组相比，ICP组ABCB4蛋白和mRNA较正常晚孕组的表达明显下降，并且ABCB4 mRNA与脐血和母血甘胆酸呈负相关性，ABCB4蛋白在胎盘的作用可能类似于毛细胆管上的ABCB4蛋白，对维持胎盘的物质转运和排毒功能可能起着必要性的作用，而ICP胎盘ABCB4蛋白表达下降可能影响胎盘排泌功能。因此，我们认为：ICP时，胎盘组织中ABCB4 mRNA 及ABCB4蛋白水平下降，也即胎盘母面的磷脂转运蛋白减少，导致胎儿胆汁酸由胎盘排泌至母体血循环减少，引起胎儿体内胆汁酸蓄积。

ICP时，ABCB4 mRNA及ABCB4蛋白表达减少，使得胎盘从胎儿至母体方向排泌胆汁酸的效率下降，导致ICP胎儿血清胆汁酸明显升高可以导致胎儿窘迫、早产、羊水粪染、死胎及死产等严重后果。本实验结果证实，在ICP组，围生儿胎儿窘迫发生率、羊水粪染发生率、早产的发生率均明显高于对照组，进一步验证了ICP时胎盘胆汁酸排泌功能受损可能是造成ICP胎儿预后不良的重要环节，而ICP胎盘排泌功能受损导致胎盘胎儿至母体方向胆汁酸浓度逆转、胎儿循环胆汁酸水平增高是其主要机制之一[8]。Sepulveda等[9]的研究发现高浓度胆汁酸有浓度依赖性血管收缩作用，可使人离体胎盘绒毛表面血管痉挛，绒毛静脉阻力增加，推测可能导致胎儿血流灌注急剧下降，胎儿急性缺氧。Altshuler[10]等认为，由于胆汁酸是胎粪的主要成分，羊水胎粪污染时，羊水胆汁酸水平明显升高，使得ICP胎盘绒毛板静脉腔内(胎儿循环)外(羊水)均暴露于高浓度的胆汁酸中，致绒毛板静脉血管收缩，可能导致胎儿急性缺氧。大量的药理学和毒理学基础研究表明[11]，胆汁酸对动物和细胞具有明显的毒理作用。口服大剂量胆汁酸可使动物迅速死亡，而长期较高浓度胆汁酸则有心脏功能抑制、血压降低、免疫功能抑制和致癌等慢性毒性作用[12]。Bristes等[13]对因ICP 而死产新生儿的心肝肾组织进行病理检查,发现心肌细胞、肝细胞、肾曲小管上皮细胞均呈空泡变性,肺泡腔充满棕黄色颗粒,肾小管管腔内可见淡黄色均质管型。目前还有研究认为[14]ICP时，孕妇血中胆汁酸及胆红素升高,高浓度的胆汁酸、胆红素通过胎盘进入胎儿体内,通过其细胞毒作用破坏线粒体膜,产生氧自由基,直接损害胎儿细胞及组织，出现呼吸功能障碍和胎儿对氧的利用障碍,加上胎盘绒毛间腔缩小,血流量减少及血液流变学异常等,使胎儿的储备力下降,易造成胎儿窘迫、死产、死胎及早产等。至于ICP组羊水粪染发生率的增高原因则可能与胎儿窘迫有直接关系。胎儿窘迫时，机体重新分布血流，血液主要分布于脑、心脏、肾上腺等重要器官，肠道和皮肤血流量减少，肠道缺血导致痉挛，肛门括约肌松弛使得大量胎粪排出，导致羊水粪染。

本实验还提示ICP组围生儿早产发生率高于对照组，这可能与 ICP组胎儿脐血中胆汁酸浓度明显增高有关。Germain等[14]通过对人子宫肌纤维的研究发现，当胆汁酸与子宫肌细胞一起培养时，缩宫素受体表达增加。因此，ICP患者的子宫肌纤维对缩宫素的敏感性增加，使早产的发生率增高。动物实验还表明，胆汁酸浓度增高可刺激胎膜、子宫内膜释放前列腺素诱导早产。另外，随着人们对ICP对围生儿影响的认识加深，医源性的剖宫产也增加了ICP患者早产的发生率。

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Down-regulationofABCB4expressioninplacentainhibitsglycocholicacidevacuationinfetusandisrelatedwithpoorprognosis

CHEN Xin-ping,ZHANG Zhi,LIU Si-sun

(DepartmentofObstetricsandGynaecology,TheFirstAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang330006,China.E-mail:chenxpdr@163.com)

AIM: To investigate the relationship between ABCB4 (ATP-binding cassette,sub-family B,member 4) expression in placenta and glycocholic acid (GA) evacuation in fetus for evaluating the prognosis of fetus from women with intrahepatic cholestasis of pregnancy (ICP).METHODSNormal pregnant women (control group,n=30) and ICP women (ICP group,n=30) hospitalized in our department were selected.The expression of ABCB4 mRNA and protein in placenta was detected by RT-PCR and immunohistochemistry,respectively.The total bilirubin (TBIL) and alanine aminotransferase (ALT) levels in maternal blood and the GA levels in maternal or umbilical blood were measured by chemical oxidation method,enzyme kinetics method and radioimmunoassay,respectively.RESULTSThe expression of ABCB4 mRNA and protein in placenta of ICP patients was significantly lower than that of the controls (Plt;0.01).The TBIL and ALT levels in maternal blood and the GA levels in both maternal and umbilical blood of ICP women were higher than those of the controls (Plt;0.01).The GA levels in maternal and umbilical blood were negatively correlated with the ABCB4 mRNA levels in placenta (r=-0.627 andr=-0.795,respectively,Plt;0.01).In control group,the weight and Apgar scores of the newborns were higher than those in ICP group (Plt;0.01).However,the rate of stool contamination in amniotic fluid was lower in control group than that in ICP group (Plt;0.01).CONCLUSIONDown-regulation of ABCB4 expression is involved in the impairment of bile acid secretion in placenta and may be a marker for poor prognosis of the fetus from ICP women.

Intrahepatic cholestasis of pregnancy; Placenta; Glycocholic acid; ABCB4

1000-4718(2011)05-1012-04

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.05.035

2010-12-26

2011-03-24

△通讯作者 Tel:0791-8692551;E-mail:chenxpdr@163.com