点地梅提取物saxifragifolin B体外抗实体瘤活性研究*

李朋军， 沈伟哉， 叶文才， 张冬梅， 孙 艳

(暨南大学1医学院，2药学院，广东 广州 510632；3广东药学院生命科学与生物制药学院，广东 广州 510006)

点地梅提取物saxifragifolin B体外抗实体瘤活性研究*

李朋军1， 沈伟哉1， 叶文才2， 张冬梅2， 孙 艳3△

(暨南大学1医学院，2药学院，广东 广州 510632；3广东药学院生命科学与生物制药学院，广东 广州 510006)

目的： 初步探讨点地梅提取物saxifragifolin B体外抗实体瘤活性及其作用机制。方法Saxifragifolin B作用于体外培养的人肝癌细胞BEL-7402、肺癌细胞A549和胃癌细胞SGC7901。光镜下观察肿瘤细胞形态学变化；AO/EB双染法观察细胞死亡；MTT法检测细胞增殖水平，计算IC50；流式细胞术检测细胞凋亡和坏死。结果Saxifragifolin B诱导3种实体瘤细胞出现凋亡样和坏死样改变。Saxifragifolin B以浓度依赖的方式抑制肿瘤生长，作用24 h IC50分别为13.13 μmol/L、9.61 μmol/L和11.64 μmol/L。Saxifragifolin B可以诱导肿瘤细胞凋亡和坏死。结论点地梅提取物saxifragifolin B具有抗多种实体瘤的活性，其作用机制可能与诱导细胞凋亡和促进细胞坏死有关。

点地梅； Saxifragifolin B； BEL-7402细胞； A549细胞； SGC7901细胞

天然产物广泛存在于自然界，资源丰富而且类型多样，因此是目前发展抗肿瘤药物最重要的策略之一[1]。我国传统中药是天然产物的重要来源。中药中提取的多种天然产物显示了良好的抗肿瘤活性[2,3]。近来，有研究报道从报春花科(Primulaceae)点地梅属植物点地梅[Androsaceumbellata(Lour.)Merr.]中首次分离得到7种化合物[4]，并发现三萜皂苷saxifragifolin B可以诱导肝癌细胞株HepG2凋亡[5]。本实验通过研究saxifragifolin B对人肝癌细胞BEL-7402、肺癌细胞A549和胃癌细胞SGC7901形态及增殖的影响，初步探讨点地梅提取物saxifragifolin B对其它实体瘤细胞株的抑制作用及机制，为深入阐明saxifragifolin B抗肿瘤作用机制及其临床应用奠定基础。

材 料 和 方 法

1药物

Saxifragifolin B，白色无结晶粉末，经鉴定为3-O{β-D-吡喃木糖-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖-(1→4)-[β-D-吡喃葡萄糖(1→2)]-α-L-阿拉伯糖}-16α-羟基-13β，28-环氧-齐墩果烷-30-醛，saxifragifolin B结构见图1，暨南大学药学院叶文才教授惠赠。用二甲亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)溶解saxifragifolin B，制备浓度为20 mmol/L的储存液，-20 ℃保存。

Figure 1.Chemical structure of saxifragifolin B.

2细胞株

人肝癌细胞株BEL-7402、人肺腺癌细胞株A549和人胃癌细胞株SGC7901由暨南大学生化教研室提供。

3主要试剂

RPMI-1640购自Gibco，胎牛血清购自杭州四季青公司，丫啶橙(acridine orange，AO)、溴化乙啶(ethidium bromide,EB)购自Fluka，MTT购自Sigma，AnnexinⅤ-FITC 凋亡检测试剂盒购自Biovision。

4方法

4.1AO/EB双荧光染色 收集对数生长期的肿瘤细胞。完全培养基(含10％胎牛血清的RPMI-1640)调整细胞浓度，按1×106cells/well接种24孔板，saxifragifolin B处理6h后，PBS洗2遍，滴加2 μL荧光标记物(AO/EB各含100mg/L)，避光染色，PBS洗2遍，滴加90％甘油，荧光显微镜下观察拍照。设置阴性对照组(加入1‰DMSO)。

4.2MTT法检测细胞增殖 收集对数生长期的细胞。完全培养基调整细胞浓度，按7×103cells/well接种96孔板。设置空白对照组、阴性对照组和6个实验组，每组设置4个复孔。细胞接种24 h后加入saxifragifolin B，使其终浓度为4 μmol/L、6 μmol/L、8 mol/L、10 μmol/L、12 μmol/L、14 μmol/L。空白对照组加入等体积完全培养基。阴性对照组加入1‰DMSO。分别于药物作用24 h、48 h、72 h后，加MTT(10 g/L)继续培养4 h。弃上清，每孔加入150 μL DMSO溶解，待完全溶解后振荡均匀，酶标仪测定490 nm处A值。计算半数抑制浓度(50％ inhibition concentration,IC50，μmol/L)。培养人脐静脉内皮细胞株HUVECs，按以上MTT方法检测saxifragifolin B作用24 h对正常细胞的毒性作用，计算半数致死浓度CC50(50％ cytotoxicity concentration)。

4.3流式细胞术检测细胞凋亡和坏死 按试剂盒说明书操作。收集对数生长期的肿瘤细胞。完全培养基调整细胞浓度，按5×105cells/well接种6孔板。细胞接种24 h后加入saxifragifolin B。设置阴性对照组。药物作用24 h后收集细胞，PBS洗2次。500 μL binding buffer重悬细胞，加5 μL Annexin V-FITC 和5 μL PI，室温避光染色5 min后流式细胞仪检测。

5统计学处理

结 果

1SaxifragifolinB对3种实体瘤细胞生长的影响

Saxifragifolin B 作用24 h，3种实体瘤细胞出现明显的形态学变化。对照组BEL-7402、A549、SGC7901细胞体外培养24 h分别呈多边形、梭形、锥形或三角形，见图2A、C、E。细胞折光性好，生长状态良好，可见较多分裂细胞。而实验组的3种肿瘤细胞形态表现相似，细胞数明显减少。部分细胞变圆，体积增大，无折光性，周围可见较多细胞碎片；部分细胞体积缩小，形成小泡，见图2B、D、F。用AO/EB双染观察saxifragifolin B作用后肿瘤细胞死亡情况，结果显示药物作用6h即出现明显的细胞死亡：部分肿瘤细胞体积增大，染色质呈均匀的橙红色、部分细胞核扩张或黄绿色荧光减少消失(坏死细胞)；部分细胞核则呈现致密浓染的黄绿色荧光(凋亡细胞)，见图3B、C。对照组细胞核完整、呈均匀绿色淡染，见图3A。

2SaxifragifolinB抑制3种实体瘤细胞增殖

不同浓度药物作用不同时间，结果显示saxifragifolin B对3种实体瘤细胞的增殖均具有抑制作用。Saxifragifolin B抑制同种肿瘤细胞的作用强度在24 h、48 h和72 h时相差不大，说明saxifragifolin B的抗肿瘤作用不随时间延长而增强；但在一定浓度范围内，抑制作用随着浓度增加而增强，见图4-6。正常细胞毒性试验结果显示，saxifragifolin B对正常细胞的CC50为(21.79±1.05)μmol/L。而saxifragifolin B抑制实体瘤的IC50水平在10 μmol/L左右，见表1。

Figure 2.Effect of saxifragifolin B on the growth of BEL-7402,A549 and SGC7901 cells(×200).A: control group of BEL-7402 cells for 24 h; D: BEL-7402 cells were treated with 10 μmol/L saxifragifolin B for 24 h; B: control group of A549 cells for 24 h; E: A549 cells were treated with 10 μmol/L saxifragifolin B for 24 h; C: control group of SGC7901 cells for 24 h; F: SGC7901 cells were treated with 10 μmol/L saxifragifolin B for 24 h.

Figure 3.Saxifragifolin B induced apoptosis and necrosis in BEL-7402 cells(×400).Cells were stained with both AO and EB.Triangle：necrosis.Arrow: apoptosis.A: control group cells for 6 h;B: BEL-7402 cells were treated with 10 μmol/L saxifragifolin B for 6 h;C: BEL-7402 cells were treated with 12 μmol/L saxifragifolin B for 6 h.

Figure 4.Saxifragifolin B inhibited the proliferation of BEL-7402 cells.±s.n=4.

Figure 5.Saxifragifolin B inhibited the proliferation of A549 cells±s.n=4.

Figure 6.Saxifragifolin B inhibited the proliferation of SGC7901 cells±s.n=4.

3SaxifragifolinB诱导肿瘤细胞凋亡和坏死

Annexin V/PI双染检测肿瘤细胞死亡情况，结果显示8 μmol/L作用24 h既诱导部分肿瘤细胞发生早期凋亡(Annexin V-FITC+)，又促进部分肿瘤细胞坏死(PI+)，见图7。Saxifragifolin B处理组肿瘤细胞凋亡和坏死水平分别与对照组相比存在显著差异(Plt;0.01)，见图8、9。上述结果说明saxifragifolin B可以显著诱导3种实体瘤细胞凋亡和坏死。

表1 Saxifragifolin B对3种实体瘤细胞的增殖抑制作用

Figure 7.Saxifragifolin B induced apoptosis and necrosis in SGC7901 cells.SGC7901 cells were stained by Annexin V-FITC(FL1) and PI(FL3).Levels of apoptosis and necrosis were analysis by flow cytometry.A: control group cells for 24 h; B: SGC7901 cells were treated with 4 μmol/L saxifragifolin B for 24 h; C: SGC7901 cells were treated with 8 μmol/L saxifragifolin B for 24 h.

Figure 8.Apoptosis induced by saxifragifolin B in three kinds of solid tumors±s.n=3.Three kinds of solid tumors were treated with 8μmol/L saxifragifolin B for 24 h.Apoptotic rate was analyzed by flow cytometry.**Plt;0.01 vs control.

Figure 9.Necrosis induced by saxifragifolin B on three kinds of solid tumors±s.n=3.Three kinds of solid tumors were treated with 8 μmol/L saxifragifolin B for 24 h.Necrotic rate was analyzed by flow cytometry.**Plt;0.01 vs control.

讨 论

点地梅是报春花科点地梅属多年生植物，其全草均可入药，《中药大辞典》载:“性味苦寒，功效利水，主治热性水肿”，民间用全草治疗扁桃腺炎、咽喉炎、口腔炎，故有喉咙草之称[6]。李承花[4]利用硅胶柱层析、Sephadex LH20柱层析以及反相柱层析等方法分离纯化点地梅全草得到7种化合物，通过理化性质和波谱技术鉴定分别为山柰酚(kaempferol)、芦丁(rutin)、槲皮素(quercetin)、primulanin、saxifragifolin B和saxifragifolin D和胡萝苷(daucosterol)。Park等[7]也通过甲醇提取，正丁醇萃取，柱层析等方法获得4种三萜皂苷：saxifragifolin C、saxifragifolin A、saxifragifolin B和saxifragifolin D。点地梅正丁醇粗提物具有抗肿瘤活性[8]。其中，saxifragifolin B可以诱导肝癌细胞株HepG2凋亡[4]，而4种三萜皂苷saxifragifolin C、saxifragifolin A、saxifragifolin B和saxifragifolin D对多药耐药肿瘤细胞株和非多药耐药肿瘤细胞株均有较敏感的抑制作用[7]。

本研究探讨了点地梅提取物saxifagifolin B对其它实体瘤的作用，结果发现saxifragifolin B对人肝癌细胞BEL-7402、肺癌细胞A549和胃癌细胞SGC7901均有抑制作用，且与Saxifagifolin B致正常内皮细胞的毒性作用相比较强(见结果2)。但与文献报道[5]不同的是，我们发现saxifragifolin B抑制实体瘤的作用具有浓度依赖性，但没有时间依赖性，6 h即可见明显的细胞死亡。形态学观察显示：saxifragifolin B作用后3种实体瘤的形态学表现相似。部分肿瘤细胞呈坏死样改变；而部分细胞呈凋亡样改变。进一步采用流式检测发现，saxifragifolin B既能诱导3种实体瘤发生早期凋亡，又能直接导致细胞坏死。提示saxifragifolin B抑制肿瘤的作用没有明显的选择性，其作用机制可能同时存在诱导细胞凋亡和促进坏死。

以往研究仅报道了saxifragifolin B诱导凋亡的作用[5,7]，并发现caspase-8/caspase-3、线粒体细胞色素C/caspase-9途径参与了凋亡发生。然而越来越多的报道显示，促进肿瘤发生被动性细胞死亡也是抗肿瘤药物重要的作用机制之一。其中，以细胞肿胀、胞浆空泡形成、无染色质浓缩的核扩张为特点的细胞胀亡(oncosis)备受关注[9]。Du等[10]发现青蒿琥酯(artesunate)有选择性抗胰腺癌细胞Panc-1、 BxPC-3 和 CFPAC-1活性，电镜观察药物作用后肿瘤细胞呈胀亡的典型表现。这种细胞死亡与caspase分子无关，但可被活性氧(ROS) 清除剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-cysteine，NAC)抑制。本研究初步的形态学观察和流式检测显示，saxifragifolin B可诱导肿瘤发生具有胀亡特点的形态学表现(如细胞变大、核扩张)及细胞被动性坏死，但saxifragifolin B是否通过胀亡途径诱导肿瘤死亡还需进一步的实验确定。

本研究证实saxifragifolin B具有潜在广谱抗实体瘤活性，而其抗肿瘤作用机制的深入阐明将有助于发展saxifragifolin B的临床应用。

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ActivityofsaxifragifolinBfromAndrosaceumbellataagainstsolidtumorsinvitro

LI Peng-jun1,SHEN Wei-zai1,YE Wen-cai2,ZHANG Dong-mei2,SUN Yan3

(1SchoolofMedicine,2CollegeofPharmacy,JinanUniversity,Guangzhou510632,China;3LifeScienceandBiopharmaceuticalCollege,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China.E-mail:sxmshw77@163.com)

AIM: To investigate the activity of saxifragifolin B fromAndrosaceumbellataagainst solid tumors.METHODSHuman hepatoma cell line BEL-7402,human lung adenocarcinoma epithelial cell line A549 and human gastric cancer cell line SGC7901 were treated with saxifragifolin Binvitro.Morphological changes of the tumor cells were observed under microscope.Cell deaths were determined by AO/EB double staining.Cell proliferation was assayed by MTT method.The IC50values were graphically determined.Apoptosis and necrosis were measured by flow cytometry.RESULTSSaxifragifolin B induced apoptosis and necrosis in all 3 tested solid tumor cells.Saxifragifolin B inhibited proliferation of tumor cells in a concentration-dependent manner with IC50values of 13.13 μmol/L,9.61 μmol/L and 11.64 μmol/L at 24 h,respectively.Saxifragifolin B induced both apoptosis and necrosis in the tumor cells.CONCLUSIONSaxifragifolin B fromAndrosaceumbellatahas the activity against a variety of solid tumors with the possible mechanisms of inducing both apoptosis and necrosis.

Androsaceumbellata; Saxifragifolin B; BEL-7402 cells; A549 cells; SGC7901 cells

1000-4718(2011)05-0838-05

R931.71

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.05.002

2011-01-05

2011-03-08

国家自然科学基金资助项目(No.81000923)；广东省医学科学技术研究基金资助项目(No.B2009117);广东高校优秀青年创新人才培育资助项目(No.2009400)

△通讯作者Tel:020-31897359; E-mail: sxmshw77@163.com