武汉汉族新生儿中肺表面活性物质蛋白D基因多态性及其与支气管肺发育不良相关性分析*

周玉容， 常立文， 李文斌， 刘 伟， 曾凌空， 张 佳， 单瑞艳， 潘 睿

(华中科技大学同济医学院附属同济医院儿科,湖北 武汉 430030)

武汉汉族新生儿中肺表面活性物质蛋白D基因多态性及其与支气管肺发育不良相关性分析*

周玉容， 常立文△， 李文斌， 刘 伟， 曾凌空， 张 佳， 单瑞艳， 潘 睿

(华中科技大学同济医学院附属同济医院儿科,湖北 武汉 430030)

目的： 研究武汉汉族新生儿中肺表面活性物质蛋白D(SP-D)基因多态性及其与支气管肺发育不良(BPD)易感性的相关关系。方法采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)对218例武汉汉族新生儿SP-D相关位点进行基因型检测,同时进行基因测序验证结果。结果SP-DMet11Thr三种基因型TT、TC、CC频率分别为10.5％、49.1％、40.4％，等位基因T和C频率分别为35.1％和64.9％。SP-DAla160Thr三种基因型GG、GA、AA频率分别为54.6％、39.4％、6.0％，等位基因G和A频率分别为74.3％和25.7％。与对照组比，SP-DMet11Thr和SP-DAla160Thr基因多态性与BPD发生率无明显关联(Pgt;0.05)。结论SP-DMet11Thr和SP-DAla160Thr基因型和等位基因频率存在种族差异性；SP-DMet11Thr和SP-DAla160Thr基因多态性与BPD发生率无明显关联。

肺表面活性物质蛋白D； 等位基因； 基因型； 基因多态性； 支气管肺发育不良

肺表面活性物质(pulmonary surfactant,PS)分布于肺泡液体分子层表面，具有降低肺泡表面张力防止呼气时肺泡塌陷的作用。肺表面活性物质由肺泡Ⅱ型上皮细胞分泌，它由磷脂和肺表面活性蛋白(surfactant proteins，SPs)组成。肺表面活性物质蛋白包括SP-A、SP-B、SP-C、SP-D。其中SP-D属于C型凝集素家族，同SP-A一样是肺组织天然免疫的重要组成部分，而且它可以调节肺的炎症过程[1]。SP-D除了在肺部炎症和感染过程中起重要作用外，它还参与了肺表面蛋白的调节过程[2]。鉴于SP-D在维持肺组织功能方面的作用，它是研究新生儿肺疾病很好的候选基因[3]。SP-D基因研究得较多的是氨基酸残基11密码子(SP-DMet11Thr)和氨基酸残基160密码子(SP-DAla160Thr)的多态性[4]。SP-DMet11Thr 多态性与血清SP-D水平相关且T等位基因与较高的SP-D水平相关，SP-D水平80％由遗传因素决定，Met11Thr多态性在其中起了一半决定作用[5]。SP-D外显子5上基因多态性位点SP-DAla160Thr可导致SP-D氨基酸的改变，最新研究证明它的多态性还与溃疡性结肠炎相关[6]。

支气管肺发育不良(bronchopulmonary dysplasia,BPD)是长时间机械通气早产儿的常见病因。近年来随着早产儿存活率升高，BPD发病率呈上升趋势。BPD是一种多因素疾病，其本质是在遗传易感性的基础上,氧中毒、气压伤、容量伤以及感染或炎症等各种不利因素对发育不成熟的肺组织所导致的损伤,及其异常修复[7，8]。本研究以武汉汉族新生儿为研究对象，探讨了武汉新生儿SP-D等位基因频率分布。同时采用随机病例-对照研究方法探讨了SP-DMet11Thr和SP-DAla160Thr基因多态性与BPD发生的关系。

材 料 和 方 法

1研究对象

选择2008年7月至2010年5月就诊同济医院的武汉地区汉族新生儿218例，其中男138例，女80例。所有符合BPD诊断[8]患儿共32例(男22例，女10例)选为病例组。BPD最重要的流行病因素是小胎龄和低出生体重[9]，我们对BPD胎龄和出生体重进行统计学分析发现胎龄lt;35周，出生体重均在2 kg以下。因此我们以胎龄﹤35周，出生体重﹤2 kg非BPD患儿64例为对照组(男48例，女16例)，并排除致死性先天畸形、严重的先天性心脏病等疾病。另外对照组存活均≥28 d。本研究由华中科技大学同济医学院附属同济医院伦理委员会批准并获得研究对象父母的知情同意。

2方法

2.1标本采集及基因组DNA抽提 抽取EDTA或肝素抗凝血0.5 mL，-20 ℃保存，用以提取基因组DNA。DNA抽提采取传统的酚氯仿抽提法。抽提步骤如下：冻存血自然解冻后加等量磷酸盐缓冲液(PBS)混匀，3 000 r·min-1离心15 min;弃上清，加细胞裂碎液150 μL，37 ℃水浴60 min后加20％十二烷基硫酸钠(SDS)25 μL和蛋白酶K 20 μL，37 ℃水浴过夜；次日取消化的细胞液按3∶1加酚氯仿异戊醇混匀，3 000 r·min-1离心10 min；酚氯仿异戊醇重复抽提1次；取上层加冰无水乙醇800 μL和醋酸钠15 μL使DNA沉淀，70％乙醇洗涤后加TE缓冲液(Tris-EDTA)20 μL溶解DNA；-20 ℃保存备用。

2.2聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)和基因测序 采用PCR技术，引物设计按文献[10]。引物对中设计了错配碱基(下划线标出，见表1)，用以导入限制性内切酶识别位点。PCR反应体系20 μL，含10 μL 2×PCR PLUS MIX(DBI)，1.2 μL DNA模板，上、下游引物各0.5 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min,94 ℃变性30 s,60 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,共45个循环。72 ℃终末循环10 min。PCR扩增产物6 μL分别用FspⅠ(Toyobo)DraⅢ(NEB)酶切，反应体系15 μL，含FspⅠ、DraⅢ酶各4 U、5 U，37 ℃消化过夜。取5 μL酶消化产物和3 μL 6×上样缓冲液进行琼脂糖凝胶(浓度3％)电泳分离，紫外光下观察并照相。参照DNA分子量标准(TaKaRa DL500 DNA marker)根据电泳条带位置判断基因型。上述PCR扩增产物随机抽取部分送华大基因进行测序验证，测序引物由华大基因设计，见表1。

表1 SP-D引物序列、限制性内切酶和酶切后片段长度及测序引物

3统计学处理

通过基因型频率计算等位基因频率，以Hardy-Weinberg平衡检验确认样本的群体代表性。武汉新生儿基因型以及基因频率分布的比较采用Pearson2检验。BPD组与对照组基因型及等位基因频率比较分别用Fisher确切概率法。Plt;0.05 为显著差异。Hardy-Wenberg平衡检验、基因频率、等位基因频率比较用Popgene 1.31统计软件进行分析。其它数据分析采用 SPSS 11.5 for Windows 统计软件。

结 果

1SP-DMet11Thr和SP-DAla160Thr基因分型

SP-DMet11Thr基因经PCR扩增产物大小为139 bp。经FspⅠ酶切后产生3种基因型，其基因型和对应酶切后长度为: CC(139 bp)、TC (107 bp、139 bp)和 TT(107 bp)。SP-DAla160Thr基因经PCR扩增产物大小为161 bp。经DraⅢ酶切后产生 3 种基因型，其基因型和对应酶切后长度为： GG(161 bp)、GA(132 bp、161 bp)、AA(132 bp)。PCR-RFLP检测SP-DMet11Thr和SP-DAla160Thr基因分型结果与直接DNA测序结果完全吻合。

2武汉汉族新生儿SP-DMet11Thr和SP-DAla160Thr基因型及等位基因频率分布

选择2008年7月至2010年5月就诊同济医院的武汉地区汉族新生儿218例进行基因型的检测。经Hardy-Weinberg平衡检验人群基因型达到遗传平衡(Pgt;0.05)，具有群体代表性。SP-DMet11Thr三种基因型TT、TC、CC频率分别为10.5 ％、49.1 ％、40.4 ％，等位基因T频率为35.1 ％，等位基因C频率为64.9 ％。SP-DAla160Thr三种基因型GG、GA、AA频率分别为54.6 ％、39.4 ％、6.0 ％，等位基因G频率74.3 ％，等位基因A频率25.7 ％。

3不同国家地区SP-DMet11Thr和SP-DAla160Thr基因多态性分布的比较

我们比较了不同国家SP-DMet11Thr 和SP-DAla160Thr基因型和等位基因频率。SP-DMet11Thr等位基因T频率德国人为62.2 ％[4]，墨西哥人为61.0 ％[11]，日本人为41.2 ％[6]，汉族新生儿(本例对照)为34.0 ％。SP-DAla160Thr等位基因G在德国人为40.0 ％[4]，墨西哥人为60.0％[11]，日本人为68.4 ％[6]，而中国人为80.0 ％。不同国家SP-DMet11Thr 和SP-DAla160Thr基因型见表2。从表2可见本研究对照组基因型频率与日本人较接近。武汉新生儿与其他3种群基因型及等位基因频率Pearson2检验显示：武汉新生儿等位基因频率与德国人、墨西哥人及日本人相比有显著差异(Plt;0.05)；武汉新生儿基因型频率与德国人和墨西哥人相比有显著差异(Plt;0.05)，与日本人比差异不明显(Pgt;0.05)。

4SP-DMet11Thr和SP-DAla160Thr多态性与BPD发生的关系

BPD与对照组在性别构成、胎龄、出生体重等方面无显著差异(Pgt;0.05)。SP-DMet11Thr和SP-DAla160Thr基因型频率和等位基因频率在BPD和对照组中差异无统计学意义(Pgt;0.05)，见表3。

表3 BPD组和对照组SP-D Met11Thr 和SP-D Ala160Thr基因型及等位基因频率分布

讨 论

编码SP-D的基因位于人类10号染色体的长臂q22.2-23.1区域，编码SPA的基因也位于10号染色体长臂上。本文研究的多态性位点SP-DMet11Thr 和SP-DAla160Thr在SP-D氨基酸末端和胶原结合区域。

我们对不同国家地区SP-DMet11Thr 和SP-DAla160Thr基因多态性的比较结果，进一步证实SP-DMet11Thr 和SP-DAla160Thr基因型和等位基因频率存在种族差异性。大部分关于SP-D基因多态性与疾病的相关性主要在肺部疾病方面，尤其是肺部感染。众多严重慢性和炎症性肺部疾病存在SP-D血清水平升高现象，如间质性肺炎、特发性肺纤维化、肺泡蛋白沉积症、嗜酸性肺炎、急性呼吸窘迫综合症和囊性纤维化等[10,12]。已证实SP-DThr11等位基因是结核病的易感基因[13]，在此位点上的另一个等位基因SP-DMet11与严重呼吸道合胞病毒毛细支气管炎相关[11]。研究SP-DMet11Thr 和SP-DAla160Thr基因多态性种族差异性有利于了解某些疾病(尤其是SP-D相关性疾病)在某些种族中的易感性，从而有利于采取针对性的预防措施并最终找到治疗方法(如基因治疗,其已在积极研究中[14])。

而关于SP-D基因多态性与BPD关联研究较少，目前国内尚无此类报道。国外有家系研究显示单倍体型SPD-160(G)SPA2(1A2)和SPD-11(C)160(G)SPA2(1A2)是BPD保护性基因[15]。本研究结果显示SP-DMet11Thr和SP-DAla160Thr基因型频率和等位基因频率在BPD和对照组中差异无统计学意义(Pgt;0.05)。鉴于本研究样本量较小,且SP-D基因存在种族或地域差异性，本研究并不能完全确定SP-DMet11Thr和SP-DAla160Thr与BPD发生无关。因此下一步有必要扩大样本量进行研究，如有条件还可采用更加严格的家系或双胎研究分析，以进一步明确SP-DMet11Thr和SP-DAla160Thr多态性与BPD的发生之间是否存在相关。

[1]LeVine AM,Whitsett JA,Gwozdz JA,et al.Distinct effects of surfactant protein A or D deficiency during bacterial infection on the lung[J].J Immunol,2000,165(7): 3934-3940.

[2]Ikegami M,Na CL,Korfhagen TR,et al.Surfactant protein D influences surfactant ultrastructure and uptake by alveolar type II cells[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2005,288(3): L552-L561.

[3]Floros J,Kala P.Surfactant proteins: molecular genetics of neonatal pulmonary diseases[J].Annu Rev Physiol,1998,60:365-384.

[4]Hilgendorff A,Heidinger K,Bohnert A,et al.Association of polymorphisms in the human surfactant protein-D (SFTPD) gene and postnatal pulmonary adaptation in the preterm infant[J].Acta Paediatr,2009,98(1):112-117.

[5]Sorensen GL,Hjelmborg JB,Kyvik KO,et al.Genetic and environmental influences of surfactant protein D serum levels[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2006,290(5): L1010-L1017.

[6]Tanaka M,Arimura Y,Goto A,et al.Genetic variants in surfactant pulmonary-associated protein D (SFTPD) and Japanese susceptibility to ulcerative colitis[J].Inflamm Bowel Dis,2009,15(6):918-925.

[7]常立文.新生儿支气管肺发育不良诊治进展[J].临床儿科杂志,2007,25(3): 161-165.

[8]Jobe AH,Bancalari E.Bronchopulmonary dysplasia[J].Am J Respir Crit Care Med,2001,163(7):1723-1729.

[9]Capoluongo E,Ameglio F,Lulli P,et al.Epithelial lining fluid free IGF-I-to-PAPP-A ratio is associated with bronchopulmonary dysplasia in preterm infants[J].Am J Physiol Endocrinol Metab,2007,292(1)：E308-E313.

[10]Glas J,Beynon V,Bachstein B,et al.Increased plasma concentration of surfactant protein D in chronic periodontitis independent of SFTPD genotype: potential role as a biomarker[J].Tissue Antigens,2008,72(1):21-28.

[11]Lahti M,Lofgren J,Marttila R,et al.Surfactant protein D gene polymorphism associated with severe respiratory syncytial virus infection[J].Pediatr Res,2002,51(6): 696-699.

[12]Honda Y,Kuroki Y,Matsuura E,et al.Pulmonary surfactant protein D in sera and bronchoalveolar lavage fluids[J].Am J Respir Crit Care Med,1995,152(6 Pt 1): 1860-1866.

[13]Floros J,Lin HM,Garcia A,et al.Surfactant protein genetic marker alleles identify a subgroup of tuberculosis in a Mexican population[J].J Infect Dis,2000,182(5):1473-1478.

[14]惠海鹏，李小鹰，刘 涛，等.经腹心包腔内注射术在慢性心力衰竭大鼠基因治疗中的应用[J].中国病理生理杂志，2005,21(4)：674-678.

[15]Pavlovic J,Papagaroufalis C,Xanthou M,et al.Genetic variants of surfactant proteins A,B,C,and D in bronchopulmonary dysplasia[J].Dis Markers,2006,22(5-6):277-291.

PolymorphismsofsurfactantproteinDandassociationbetweenpolymorphismsandbronchopulmonarydysplasiainHanracialWuhannewborns

ZHOU Yu-rong,CHANG Li-wen,LI Wen-bin,LIU Wei,ZENG Ling-kong,ZHANG Jia,SHAN Rui-yan,PAN Rui

(DepartmentofPediatrics,TongjiHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030,China.E-mail:lwchang@tjh.tjmu.edu.cn)

AIM: To analyze the genetic polymorphisms of surfactant protein D (SP-D) and to investigate the association between polymorphisms and bronchopulmonary dysplasia (BPD) in Han racial Wuhan newborns.METHODSGenotyping ofSP-Dpolymorphisms was performed by polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism analysis (PCR-RFLP) in 218 Han racial Wuhan newborns.The method of gene sequencing was used to validate the results.RESULTSThe frequencies of TT,TC,CC ofSP-DMet11Thr were 10.5％,49.1％ and 40.4％,respectively,and the allele frequencies of T and C were 35.1％ and 64.9％,respectively.The frequencies of GG,GA,AA ofSP-DAla160Thr were 54.6％,39.4％ and 6.0％,respectively,and the allele frequencies of G and A were 74.3％ and 25.7％.SP-DMet11Thr andSP-DAla160Thr displayed no significant association with BPD as compared with control group.CONCLUSIONThe differences inSP-DMet11Thr andSP-DAla160Thr polymorphisms are significant among several ethnic groups.Polymorphisms ofSP-DMet11Thr andSP-DAla160Thr display no significant association with BPD as compared with control group.

Pulmonary surfactant-associated protein D； Alleles； Genotype； Gene polymorphism; Bronchopulmonary dysplasia

1000-4718(2011)05-0968-04

R363; R722

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.05.025

2010-11-23

2011-02-20

国家自然科学基金资助项目(No.30872795)；湖北省自然科学基金资助项目(No.2008CDB139)；新教师基金资助项目(高等学校博士学科点专项科研基金，No.200804871058)

△ 通讯作者 Tel：027-83663345;E-mail：lwchang@tjh.tjmu.edu.cn