磷酸肌酸钠对阿霉素所致心肌损伤的影响*

赵文英， 陈冬云， 齐 全

(皖南医学院附属弋矶山医院肿瘤内科,安徽 芜湖 241000)

磷酸肌酸钠对阿霉素所致心肌损伤的影响*

赵文英△， 陈冬云， 齐 全

(皖南医学院附属弋矶山医院肿瘤内科,安徽 芜湖 241000)

目的： 探讨磷酸肌酸钠对阿霉素所致小鼠心肌损伤的保护作用及机制。方法60只雌性BALB/c小鼠随机分为磷酸肌酸钠干预组、阿霉素组和正常对照组，观察小鼠的一般情况，检测血清中肌钙蛋白I(TnI)、N端前脑钠肽(NT-proBNP)及心肌组织中丙二醛(MDA)、ATP酶的变化，心肌细胞凋亡及心肌组织bcl-2、fas基因的表达。结果与对照组及磷酸肌酸钠组比较，阿霉素组心肌细胞发生明显的水肿变性，并可见部分细胞凋亡，凋亡指数增大(Plt;0.05)；阿霉素组MDA明显增高 (Plt;0.05)，ATP酶活力降低(Plt;0.05)；血清中TnI和NT-proBNP有增高的趋势(Pgt;0.05)；磷酸肌酸钠组与阿霉素组比较，bcl-2基因表达增多，fas基因表达减少(Plt;0.05)。结论磷酸肌酸钠对阿霉素所致的心肌损伤具有保护作用，其机制可能与磷酸肌酸钠减少氧自由基和抑制细胞凋亡有关。

磷酸肌酸钠； 阿霉素； 细胞凋亡； 自由基

阿霉素(adriamycin，ADR)是一种广谱高效蒽环类抗肿瘤药物，在临床应用广泛。由于ADR与心肌组织的亲和力明显高于其它组织，具有严重的心脏毒性并具剂量依赖性，从而严重限制其临床应用[1]。长期使用 ADR对心脏的慢性毒性作用主要是与累积剂量有关的扩张性心肌病和充血性心力衰竭，常规药物治疗效果不理想，预后很差。其确切的病因机制尚未明确，有研究认为，ADR导致心肌损伤与其半醌自由基介导的氧自由基损伤有关[2]。磷酸肌酸作为细胞内的一种高能磷酸化合物，不仅可以在心肌细胞遭受缺血缺氧时为其提供能量，还可以保护心肌细胞膜免受氧自由基等有害物质的侵袭[3]。研究发现，磷酸肌酸可以透过细胞膜抑制膜通透性、改变孔道的开放以保护线粒体，减少细胞凋亡[4]。本实验选用小鼠作为研究对象，建立阿霉素心肌病动物模型，予以磷酸肌酸钠干预治疗，为临床有效治疗阿霉素引起的心肌病提供理论依据。

材 料 和 方 法

1动物和试剂

健康6周龄雌性BALB/c小鼠60只，体重 (20±2)g，由南京医科大学实验动物中心提供[许可证号为SCXK(苏)2007-0001]。阿霉素由浙江海正药业有限公司生产(批号为20100423)，注射用磷酸肌酸钠由吉林英联生物技术有限公司生产(批号为20091007)。ATP酶试剂盒及丙二醛(malondialdehyde,MDA)试剂盒均购自南京凯基生物工程研究所。小鼠心肌肌钙蛋白(troponin I,TnI)、N端前脑钠肽(amino-terminal pro-brain natriuretic peptide,NT-proBNP)酶联免疫试剂盒购自上海研吉生物科技有限公司。TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒购自上海生研生物科技有限公司。

2动物分组

健康6周龄雌性BALB/c小鼠，适应性喂养后，随机分为3组(每组20只)：(1)正常对照组(contro1组)：每3 d尾静脉注射生理盐水(NS)10 mL/kg，共10次；(2)阿霉素组(ADR组)：每3d尾静脉注射同容量的ADR 2 mg/kg，共10次,累积剂量20 mg/kg[5,6]；(3)磷酸肌酸钠组(sodium phosphocreatine,CP组)：每3 d尾静脉注射同容量的 ADR 2 mg/kg，共10次,累积剂量20 mg/kg，第6次时开始注射磷酸肌酸钠200 mg·kg-1·d-1，共12 d。

3标本收集

小鼠固定后，摘取眼球，取眶静脉血，制备血清。采血后，迅速开胸取出心脏，取部分心脏用于免疫组化和bcl-2、fas基因表达检测。

4观察项目与方法

4.1症状及体征 观察一般精神状况，饮食，皮毛和体重情况等。

4.2小鼠血清TnI、NT-proBNP及心肌组织中ATP酶、MDA的测定 采血后，4℃，3 000 r/min 离心后取上清，用于检测小鼠血清TnI和NT-proBNP的含量。摘除心脏后用生理盐水冲洗干净，称取约0.5 g心肌组织置匀浆器中，在0 ℃条件下制备组织匀浆，离心后取上清用于检测ATP酶活性及MDA含量，所有操作均按照试剂盒说明书进行。

4.3组织病理学检查 4％甲醛固定24 h的心肌组织用石蜡包埋，切成5 μm左右薄片，用苏木精-伊红进行染色。随机选择任意1张片的10个视野用彩色影像分析仪进行分析。组织学病变以心肌纤维消失及胞浆空泡变性程度来判定 (计分0-3)。

4.4细胞凋亡检测 TUNEL细胞凋亡原位检测按试剂盒说明书操作。(1)石蜡切片脱蜡至水化，PBS冲洗3 min×3次;(2)蛋白酶K消化15 min，PBS冲洗3 min×3次;(3)擦干组织周围水分，滴加血清(羊抗) 5 min，甩干(以减少非特异性结合);(4) 滴加25-50 μL的TUNEL反应液，37℃孵育60 min，PBS冲洗3 min×3次;(5)0.3％H2O2阻断，37 ℃湿盒中孵育10 min，PBS冲洗3 min×3次；(6) 滴加DAB底物溶液，室温5-10 min；苏木素复染、脱水、封片。细胞核呈棕黄色为TUNEL反应阳性细胞(即凋亡细胞)，光镜下分析结果，随机计数5个高倍视野下阳性细胞所占百分数即为细胞凋亡指数。

4.5半定量RT-PCR方法检测bcl-2和fas基因的表达 Trizol法提取心肌组织中的总RNA。利用RT-PCR kit(Carpentaria)合成 cDNA，设计GAPDH、bcl-2及fas基因相对应的引物(上海生工生物工程技术服务有限公司)后进行 PCR(引物序列见表1)。PCR条件分别为GAPDH：预变性94 ℃ 5 min,94 ℃ 60 s、 58 ℃ 30 s、72 ℃ 40 s，35个循环,72 ℃ 5 min；4 ℃保存。bcl-2：预变性94 ℃ 5 min,94 ℃ 60 s、54 ℃ 30 s、72 ℃ 40 s，35个循环,72 ℃ 5 min；4℃保存。fas：预变性94 ℃ 5 min,94 ℃ 60 s、56 ℃ 30 s,72 ℃ 40 s，35个循环,72 ℃ 5 min；4 ℃保存。bcl-2、fas的PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳后溴乙啶染色，用Bio-Rad凝胶成像分析系统分析并取得积分吸光度值，然后用同样方法得出的GAPDH值来校正。

表1 bcl-2、 fas和GAPDH引物序列及RT-PCR产物大小

5统计学处理

结 果

1小鼠的一般状况

正常对照组及CP组小鼠摄食、活动、粪便等一般状况良好，皮毛光滑；ADR组小鼠出现进食明显减少、活动迟缓、竖毛。

2小鼠血清TnI、NT-proBNP含量及心肌组织MDA含量、ATP酶活性的变化

阿霉素组与正常组、磷酸肌酸钠组比较MDA含量升高，ATP酶活性下降(Plt;0.05)，血清TnI和NT-proBNP的含量有升高的趋势，但无显著差异(Pgt;0.05)，见表2。

表2 小鼠TnI、NT-proBNP、MDA含量及ATP酶活性的变化

3心肌组织结构的改变

HE染色后，正常对照组：心肌组织未见明显变性； 阿霉素组：心肌组织的部分心肌细胞肿胀肥大明显，细胞内可见均匀的细小红染颗粒，并伴有水样变性(变性评分2-3分)，见表3；磷酸肌酸钠组：心肌组织少部分心肌细胞肿胀肥大，细胞轻度水样变性(变性评分1-2分),见表3、图1。

4心肌细胞凋亡指数的变化

正常对照组：心肌组织未见明显细胞凋亡改变，凋亡指数(16.23±6.11)％；阿霉素组：心肌组织中部分心肌细胞内可见棕黄色颗粒、凋亡小体及碎片，凋亡指数(28.02±6.50)％；磷酸肌酸钠组：心肌组织少部分心肌细胞内可见棕黄色颗粒，凋亡指数(20.60±5.48)％；阿霉素组凋亡指数与正常对照组、磷酸肌酸钠组比较差异显著(Plt;0.05)，见表3、图2。

表3 小鼠心肌组织细胞水肿分级及细胞凋亡指数

Figure 1.Histological changes of cardiac tissues in mice(HE staining,×400).A: contro1 group；B: ADR group；C: CP group.

Figure 2.Apoptosis were observed by TUNEL(×400).A: contro1 group；B: ADR group；C: CP group.Intracellular edema,nuclear degeneration and apoptotic bodies(black arrow) were observed in ADR group.There was no significant change in the control and CP group.

5小鼠心肌组织中的bcl-2、fas基因的表达变化

与正常组及磷酸肌酸钠组比较，阿霉素组的bcl-2基因的表达降低(Plt;0.05)，fas基因表达升高(Plt;0.05);说明磷酸肌酸钠可增加bcl-2基因表达，同时抑制fas基因表达,见图3。

Figure 3.The expression of bcl-2 and fas mRNA in mouse cardiac tissues was exzamined by RT-PCR.A,B:the electrophoretogram of RT-PCR; C,D:the homologous optical density scanning±s.n=20.*Plt;0.05 vs control group and CP group.M:marker;CON: control; ADR: adriamycin; CP: sodium phosphocreatine .

讨 论

众所周知，bcl-2基因是一有抑制细胞凋亡作用的基因，主要分布在线粒体内膜、细胞膜内表面等处。Wu等[9]用ADR处理培养的乳鼠心肌细胞，发现细胞内的bcl-2表达下降，与ADR的剂量有关。Fas蛋白是细胞膜上的跨膜蛋白，属于肿瘤坏死因子受体家族。Nakamura等[10]在ADR大鼠心肌中证实，细胞凋亡由Fas途径介导，抗Fas 的抗体能抑制ADR诱导的细胞凋亡，从而改善心功能。本实验亦发现阿霉素可使心肌细胞bcl-2基因表达减少，fas基因表达增加；阿霉素组细胞凋亡指数较正常对照组及磷酸肌酸钠组升高，提示阿霉素引起的心肌细胞损伤与细胞凋亡密切相关。

磷酸肌酸钠是人体内自有的活性物质，是人体重要的能量供应源，为ATP补充能量，而 ATP是任何细胞代谢过程中最主要的能量源。本实验中发现磷酸肌酸钠能显著降低氧自由基的产生，并提高ATP酶的活力，减轻细胞膜的脂质过氧化及细胞内钙超载，使心肌细胞损伤减轻。Broeyer等[11]研究显示阿霉素心肌病可引起心肌酶TnI及NT-proBNP水平升高，是反映心肌损伤严重程度的敏感指标，在实验中用磷酸肌酸钠干预组心肌细胞水肿不明显，血清中肌钙蛋白及前脑钠肽较阿霉素组有下降趋势，提示磷酸肌酸钠可作为一种高效供能物质对心肌细胞在代谢和功能上具有保护作用，减轻阿霉素引起的心肌损伤，改善心功能。

综上所述，磷酸肌酸钠对阿霉素心肌病的保护作用机制可能为：(1)进入细胞参与高能磷酸肌酸水平的维持；(2)提供能量，减少氧自由基的产生及细胞内钙超载对细胞的损伤；(3)通过调节bcl-2及fas基因的表达减少细胞凋亡。本研究为临床预防和治疗阿霉素心肌病提供理论依据，值得在临床进一步研究。

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多胺类对爪蟾属蝌蚪癫痫模型的神经保护作用

癫痫发作易损伤发育的中枢神经系统(CNS)。内源性的多胺(如腐胺、精脒和精胺)广泛存在于CNS，与神经性的细胞损伤有关，但其作用是减弱还是增强细胞损伤还不清楚。多胺类可作用于离子通道NMDA受体、钾通道和钙通道AMPA受体从而调节神经元的兴奋性。而神经元活性可快速调节多胺的合成和降解。神经元活性增强时，多胺合成的限速酶 - 鸟苷酸脱羧酶活性亦增强，从而导致多胺合成迅速增加。美国科学家用戊撑四唑(pentylenetetrazole，PTZ，一种惊厥剂)处理爪蟾属蝌蚪癫痫发作模型时发现，经PTZ首次处理后，第2次使用PTZ所致癫痫发作的起始时间比首次作用晚约4 h，这种保护作用是由于癫痫发作后腐胺(一种最简单的多胺)合成增多所致。腐胺不是通过直接调节离子通道，而是通过使神经元由兴奋变为抑制而发挥作用。癫痫首次发作4 h后记录顶盖神经元，发现 -氨基丁酸能(GABAergic)神经元自发性的抑制性突触后电位放电频率增加。实验证实，腐胺通过一种非经典途径转化生成 -氨基丁酸(GABA)，GABA激活抑制性中间神经元突触前GABAB受体，GABAB受体的激活使抑制性神经元代偿性的上调GABA的释放，从而产生这一效应。当腐胺和GABA的量恢复到正常水平时，抑制性的放电频率仍处于高水平。若此时癫痫再次发作，动物就会受到保护。目前尚不知癫痫发作后腐胺和(或)GABA是如何转运的。总之，癫痫发作时，多胺类对发育的大脑具有神经保护作用。

Nat Neurosci,2011,14(4):505-512(朱小青)

Effectofsodiumphosphocreatineonadriamycin-inducedcardiotoxicity

ZHAO Wen-ying,CHEN Dong-yun,QI Quan

(DepartmentofMedicalOncology,YijishanHospital,WannanMedicalCollege,Wuhu241000,China.E-mail:zhaowy98@yahoo.com.cn)

AIM: To observe the effect of sodium phosphocreatine on adriamycin-induced cardiotoxicity in mice.METHODSSixty female BALB/c mice weighing about 20 g were randomly divided into control group,adriamycin group and sodium phosphocreatine treatment group.The general conditions of the mice were observed.The content of amino-terminal pro-brain natriuretic peptide(NT-proBNP) and troponin I(TnI) in serum,the changes of malondialdehyde(MDA) concentration and ATPase activity in cardiac tissues were detected.The anti-apoptotic effect of sodium phosphocreatine was also evaluated byinsituterminal dUTP nick-end labeling (TUNEL).The mRNA levels ofbcl-2 andfaswere detected by RT-PCR.RESULTSThe intracellular edema,nuclear degeneration and apoptosis were observed in the cardiac tissues in adriamycin-treated mice.Compared with control group and sodium phosphocreatine treatment group,the apoptosis index was increased,the MDA concentrations were elevated and the activity of ATPase was decreased in mouse cardiac tissues in adriamycin group.The serum levels of TnI and NT-proBNP were increased,the expression ofbcl-2 was promoted and the expression offaswas inhibited in sodium phosphocreatine treatment group as compared to adriamycin group.CONCLUSIONSodium phosphocreatine protects mice from adriamycin-induced cardiotoxicity by reduction of oxygen free radicals and apoptosis in mouse cardiac tissues.

Sodium phosphocreatine; Adriamycin; Apoptosis; Free radicals

1000-4718(2011)05-0939-05

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.05.020

2010-12-23

2011-03-21

安徽省高等学校省级自然科学基金资助项目(No.KJ2010B252)

△通讯作者Tel：0553-5711589;E-mail：zhaowy98@yahoo.com.cn