利多卡因对SH－SY5Y 细胞的损伤作用*

2011-12-23文先杰徐世元雷洪伊郑雪琴杨承祥

中国病理生理杂志 2011年11期

文先杰，徐世元，雷洪伊，梁桦，郑雪琴，杨承祥

(1 南方医科大学珠江医院麻醉科，广东广州510282;2 佛山市第一人民医院麻醉科，广东佛山528000)

局麻药在临床常用浓度下也可导致神经细胞毒性损伤，表现为神经细胞的肿胀、退行性变，神经脱髓鞘、空泡症、染色体溶解、细胞程序性死亡等。暂时性神经病学综合征(transient neurological syndrome，TNS)和马尾综合征是临床上常见局麻药神经毒性反应［1］。SH－SY5Y 细胞株来源于人神经母细胞瘤，该细胞繁殖快，细胞形态、生理和系列化功能与正常神经细胞相似，因此该细胞是进行人类神经细胞研究较为理想的一种细胞模型［2］。本研究在SH－SY5Y 细胞体外培养的基础上，采用MTT 法和流式细胞仪技术，观察了不同浓度利多卡因对SH－SY5Y 细胞活力及细胞凋亡的影响，初步探讨利多卡因的神经毒性损伤作用。

材料和方法

1 材料

盐酸利多卡因标准品购自中国食品药品检定研究院，噻唑蓝(MTT)购自中国医药(集团)上海公司，Annexin V－FITC 细胞凋亡检测试剂盒购自BIPEC，SH－SY5Y 细胞株(中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心)。主要仪器包括全自动酶标仪(雷勃公司)，分光光度计(GBC)，流式细胞仪(BD)等。

2 方法

2.1 SH－SY5Y 细胞培养将细胞培养于DMEM 培养液内(含有4.0 mmol/L 谷氨酰胺、4.5 g/L 的葡萄糖、100 mg/L 链霉素和100 U/L 青霉素)，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，待细胞生长至约90%时用于实验。

2.2 实验分组与处理实验分为4 组，即:正常培养组(对照组，未经药物处理);0.5%、1%、2%利多卡因组(L1、L2、L3 组，相当于18.5 mmol/L、37 mmol/L、74 mmol/L 利多卡因处理细胞):分别用相应浓度的利多卡因处理SH－SY5Y 细胞10 min。

2.3 观察指标

①SH－SY5Y 细胞形态学观察药物处理10 min 后，在可见光显微镜下观察细胞形态，评价细胞受损情况。

②MTT 法检测SH－SY5Y 细胞相对活力分别在药物处理后5 min(T1)、10 min(T2)、药物处理结束后15 min(T3)、药物处理结束后12 h(T4)将细胞接种于96 孔板中，每组设6个复孔。细胞浓度为5 ×105cells/well，每孔加入MTT 溶液(5 g/L)10 μL，37 ℃继续孵育4 h，终止培养，吸去孔内培养液，每孔加入DMSO 150 μL，振荡10 min 使结晶充分溶解，于酶标仪检测A570及A630值，计算A570与A630差值，并以正常培养组的差值1，其它各时点差值与其比值(%)为反映细胞活力的参数。

③细胞凋亡检测分别在药物处理开始前(T0)、药物处理后5 min(T1)、10 min(T2)、药物处理结束后15 min(T3)、药物处理结束后12 h(T4)将各组细胞制成单细胞悬液，调整细胞悬液浓度为5 ×108cells/well，接种于96 孔培养板，每孔加入细胞悬液100 μL ，培养箱中继续培养4 h 时后检测细胞凋亡率。取SH－SY5Y 细胞，置于离心管中，以离心半径10 cm、1 500 r/min 离心5 min，收集悬浮细胞。PBS 洗涤细胞2次后，以离心半径10 cm、1 500 r/min 离心5 min，然后收集细胞。用400 μL 1 ×结合缓冲液重悬细胞。将细胞悬液移至样品试管中，加入5 μL Annexin V－FITC，轻轻混匀后于避光条件下室温24 ℃孵育15 min。加入碘化丙啶10 μL，使终浓度为50 mg/L，染色5 min，24 ℃避光30 min 后，使用流式细胞仪检测细胞凋亡情况，计算细胞凋亡率。每组设6 个复孔，每孔重复测定3 次，取平均值。

3 统计学处理

采用SPSS 11.0 统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，组内比较采用重复测量设计的方差分析，组间比较采用单因素方差分析。

结果

1 细胞形态改变

倒置显微镜下见正常培养SH－SY5Y 细胞胞体粗大，呈多角形，出现树突状突起，神经突起，多而粗大，分布成网络，表现出一系列神经元的特征。实验组不同浓度的利多卡因处理10 min 后均对SH－SY5Y 细胞形态有明显影响，细胞变圆，回缩，轴突渐消失，见图1。

Figure 1. Morphocytology of SH－SY5Y cells (×100). C:SH－SY5Y were cultured under normal conditions;L1:SH－SY5Y were cultured with 0.5% lidocaine for 10 min;L2:SH－SY5Y were cultured with 1% lidocaine for 10 min;L3:SH－SY5Y were cultured with 2% lidocaine for 10 min.图1 SH－SY5Y 细胞形态

2 细胞活力

各实验组不同浓度的利多卡因对SH－SY5Y 细胞活力均有明显影响，利多卡因处理5 min 后，各组细胞活力明显下降，且随剂量增加，细胞活力下降明显增加。2%利多卡因处理5 min 后，细胞活力下降至67%，处理10 min 后，细胞活力则下降为61%，停止利多卡因处理后15 min，细胞活力继续下降至53%，停止处理后12 h，细胞活力则恢复至65%，见表1。

表1 各组SH－SY5Y 细胞活力的比较Table 1. Cell viability of the SH－SY5Y cells in each group(%. ±s.n=6)

T1:treatment for 5 min;T2:treatment for 10 min;T3:15 min after treatment;T4:12 h after treatment. * P ＜0. 05 vs control group;#P ＜0.05 vs L1 group;△P ＜0.05 vs L2 group;▲P ＜0.05 vs T1 group.

Group T1 T2 T3 T4 Control 100 100 100 100 L1 87 ±2* 79 ±4＊▲ 70 ±4＊▲ 81 ±3＊▲L2 77 ±4* # 68 ±4* #▲ 61 ±3* #▲ 74 ±3* #L3 67 ±5* #△ 61 ±5* #△▲53 ±4* #△▲ 65 ±4* #△

3 细胞凋亡率

对照组细胞凋亡率在各时点保持在5.9% ～6.3%之间，实验组细胞在利多卡因处理后各时点细胞凋亡率明显增加，且随着浓度的增加，细胞凋亡率也增加。2%利多卡因处理5 min、10 min 及停止利多卡因处理后15 min、12 h，细胞凋亡率分别为15.5%、23.0%、22.7%和19.3%，见表2。

表2 各组SH－SY5Y 细胞凋亡率的比较Table 2. Apoptotic rate of the SH－SY5Y cells in each group (%. ±s.n=6)

T0:before treatment. * P ＜0.05 vs control group;#P ＜0.05 vs L1 group;△P ＜0.05 vs L2 group;▲P ＜0.05 vs T0 group;OP ＜0.05 vs T1 group.

Group T0 T1 T2 T3 T4 Control 6.2 ±0.5 6.1 ±0.4 6.5 ±0.5 6.1 ±0.4 6.2 ±0.4 L1 6.3 ±0.5 10.4 ±1.3＊▲ 15.0 ±0.4＊▲O 14.5 ±1.5＊▲O 9.6 ±1.7＊▲L2 6.2 ±0.4 14.1 ±1.2* #▲ 19.2 ±1.2* #▲O 19.8 ±1.3* #▲O 15.2 ±0.5* #▲L3 5.9 ±0.4 15.5 ±0.9* #▲ 23.0 ±1.8* #△▲O 22.7 ±1.7* #△▲O 19.3 ±1.0* #△▲

讨论

局麻药对神经细胞的毒性与其剂量、浓度和作用时间相关，即使在临床常用浓度下，也常导致神经细胞毒性损伤，导致的神经运动与感觉功能损害多数在数小时或数天可完全恢复，少数恢复时间更长，甚至为不可逆性。一项多中心研究发现，TNS 的发病率约为8.1%，表现为椎管内阻滞完全恢复后早期出现烧灼样、持续固定、痉挛性、放射性疼痛的症状，多发于躯干下部、一般为双侧，可沿下肢放射至其末端或背部［1］。马尾综合征发病率远低于TNS，但通常为永久性损害，表现为椎管内阻滞恢复后，持续性肛周、骶尾区、双下肢感觉和运动功能障碍。

局麻药的神经毒性作用的机制目前尚不完全明确，可能与以下几方面有关。(1)神经元兴奋性增加［3－5］。局麻药引起的暂时性神经病学综合征则表现为传入神经元兴奋性增加引起的向双下肢放射的臀部神经病理性疼痛。研究表明，利多卡因可以使神经细胞膜上的钠离子通道发生重排，使细胞内钠离子浓度及细胞膜上钠电流增加，神经细胞的兴奋性增加。(2)细胞内钙超载［6－8］。细胞内钙超载可导致线粒体膜电位的破坏和功能障碍，线粒体肿胀，功能失调，导致细胞死亡。钙超载可使一些酶激活，引起膜磷脂的分解，在分解过程中产生游离脂肪酸、前列腺素、白三烯、溶血磷脂等，均对细胞产生毒害作用。(3)p38 MAPK 途径［9，10］。p38 MAPK的激活是细胞凋亡性死亡的细胞内信号途径。研究表明，布比卡因神经毒性损伤与p38 MAPK 的激活有关。

本研究选择利多卡因的浓度分别为0.5%、1%和2%，均为临床上常用的神经阻滞浓度。实验结果表明，临床常用浓度的利多卡因也可导致离体培养的神经细胞损伤。本研究采用的是离体细胞培养模型，与在体研究存在比较大的差异。在整体实验中，制备局麻药神经损伤模型则需要较高浓度的利多卡因，通常达到5% ～10%，这可能与在体受多种因素如细胞内环境、神经元的种类等因素影响有关。关于利多卡因的在体神经损伤及其机制尚需进一步深入研究。但局麻药神经毒性损伤已经成为神经阻滞的常见不良反应，且与局麻药的浓度密切相关，因此在临床工作中，在满足临床需要的同时，应采用最低有效浓度，尽可能减少局麻药的神经毒性作用。

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