MMP－2 基因启动子区－735C→T 多态性与冠状动脉粥样硬化的相关性研究*

赵京山， 温进坤， 韩 梅

(1 河北医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室，河北 石家庄050091;2河北医科大学基础医学研究所，河北省医学生物技术重点实验室，河北 石家庄050017)

基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是一族在细胞外基质(extracellular matrix，ECM)降解中起主要作用的锌离子依赖性蛋白酶超家族。在冠状动脉粥样硬化(coronary atherosclerosis，CAS)发生发展过程中，一方面，MMPs 可通过降解细胞外基质和基底膜使内皮屏障功能降低，促进脂蛋白在内膜下沉积及炎症细胞的浸润;另一方面，通过降解ECM，影响粥样斑块的稳定性，使斑块破裂而诱发冠心病［1，2］。MMP -2 是MMPs 家族的重要成员，其作用底物主要有胶原、明胶、弹性蛋白、纤连蛋白、层黏连蛋白、蛋白聚糖、玻璃黏连蛋白等，而这些是构成血管壁ECM 和基底膜的主要成分，因此，MMP-2 在CAS 斑块形成和血管重构中的作用受到研究者的重视［3，4］。近年研究表明，MMP -2 表达水平增高与CAS 的发生密切相关［5］。

既往研究发现，在MMP－2 基因启动子区的-735位存在单个碱基置换，胞嘧啶(C)被胸腺嘧啶(T)所取代，即C→T 变异，表现为C -735C、C -735T 和T-735T 3 种基因型。因该突变位点位于转录因子Sp1 结合的顺式作用元件内，故存在影响MMP－2 表达活性的可能性［6，7］。有报道指出C -735T 多态性与冠心病发病相关;也有一些学者得出相反的研究结论，这可能是由于他们研究所采用的人群不同所致［8，9］。迄今未见汉族人群MMP－2 基因启动子区-735C→T 多态性与CAS 关联性研究的文献报道。我们应用聚合酶链反应和限制性片段长度多态性分析技术，检测了309 例经冠状动脉造影确诊的CAS 患者和同期体检311 名健康人MMP－2基因的-735C→T 多态性，旨在探讨MMP－2 基因-735C→T 多态性与中国汉族人群CAS 的遗传易感性和冠状动脉狭窄程度的关系。

材 料 和 方 法

1 病例选择

CAS 组(309 例，男203 例，女106 例)年龄45 ～82 岁，平均(59.5 ±13.1)岁。以河北医科大学第二医院、石家庄市人民医院2008 年12 月～2010 年8月住院行冠脉造影确诊为CAS 的患者为研究对象;对照组来自这2 个医院体检中心健康体检者(311例，男201 例，女110 例)，年龄44 ～85 岁，平均(61.6 ±12.9)岁。两组男女构成比及冠心病发病的主要危险因素包括吸烟、血压、血脂等方面均无明显差异，具有可比性。所有研究对象间均无血缘关系。CAS 组和对照组均空腹外周静脉采血2 mL 并用EDTA 抗凝，用于基因组DNA 提取。病变严重程度根据冠脉造影结果进行分级，有散在斑块，斑块大小没有超过管径的50%记为0，斑块大小超过管径的50%，累及单支血管的记为1，累及2 支血管的记为2，累及3 支以上血管的记为3。

2 试剂

基因组DNA 小量抽提试剂盒SK1262 为上海生工公司产品，高保真DNA 聚合酶为BBI 产品，HinfⅠ内切酶为New England Biolabs 产品，PCR 产物纯化试剂盒购自Qiagen，PCR 引物由上海生工公司合成。

3 方法

3.1 DNA 抽提 取EDTA 抗凝的静脉血0.5 mL，采用血液基因组DNA 小量抽提试剂盒，按操作说明书抽提DNA，-80 ℃冰箱保存备用。

3.2 PCR 扩增MMP－2 基因 C -735T 位点及其侧翼区:上游引物为5' - ATCCTGTGACGGAGAATG-3'，下游引物为5' - TAAAATGAGGCTGAGACC -3'，扩增片段长度为64 bp。PCR 反应体系为10 ×缓冲液2 μL ，dNTP(各10 mmol/L)1 μL。上、下游引物(各10 mmol/L)1 μL，DNA 模板0.1 μg，DNA 聚合酶2 U，加无菌双蒸水至总体积20 μL。PCR 反应条件:95 ℃预变性5 min，94 ℃45 s，56 ℃30 s，72℃30 s，30 个循环，72 ℃10 min。反应结束后，经12%PAGE 凝胶电泳，溴化乙啶染色后，用凝胶成像仪检测PCR 产物特异性，采用PCR 纯化试剂盒纯化PCR 产物。

3.3 酶切反应 反应体系包括PCR 纯化产物1 μg，10 ×缓冲液1 μL，HinfⅠ1.5 U，加双蒸水至10 μL 体积;置37 ℃16 h，终止酶切反应，12%PAGE 凝胶电泳后，溴化乙啶染色，凝胶成像系统判定结果。

4 统计学处理

等位基因频率计算:等位基因频率=(2 ×纯合子数+杂合子数)/2 ×受检人数。数据以均数±标准差(± s)表示。采用SPSS 10.0 软件进行处理。用基因计数法计算CAS 组和正常对照组的基因型和等位基因频率(构成比)。各组基因型和等位基因频率之间比较采用χ2检验。

结 果

1 临床资料

对照组和CAS 组在性别、年龄、体重指数、血压、吸烟史及吸烟之间均无显著差异，见表1。CAS 典型的冠脉造影结果如图1 所示。

2 基因型分析

PCR 扩增产物为64 bp 的DNA 片段，扩增产物经回收、纯化、限制性内切酶Hinf I 酶切后，12%PAGE 凝胶电泳，溴化乙啶染色，凝胶成像仪检测MMP－2 基因型。在野生纯合子基因型(C-735C)，不存在Hinf I 的酶切位点，PCR 产物不能被切断，只有64 bp 一个片段;当C-735 等位基因被T-735 等位基因取代(T-735T)时，则形成Hinf I 的酶切位点GANTC，PCR 产物经Hinf I 酶切后形成43 bp 和21 bp 两个片段;而仅一条染色体突变时(C -735T)时，则出现64 bp、43 bp 和21 bp 三个片段。因21 bp的DNA 片段较小，12%的凝胶电泳未能检出，因此，经PAGE 电泳后，CC 基因型可见64 bp 一条带，CT 基因型为64 bp 和43 bp 两条带，TT 基因型为43 bp 一条带，见图2。

表1 对照组和CAS 组的临床特征Table 1. Clinical characteristics in control group and CAS group(±s)

表1 对照组和CAS 组的临床特征Table 1. Clinical characteristics in control group and CAS group(±s)

Clinical characteristics Control CAS P Sex Male 201 203 ＞0.05 Femal 110 106 Age (years) 61.6±12.9 59.5±13.1 ＞0.05 BMI 21.3±0.8 21.8±0.7 ＞0.05 BP(mmHg) 128.1±5.6 129.6±6.1 ＞0.05 Smoking status Non-smoker 132 137 ＞0.05 Smoker 170 172

Figure 1. Representative results of coronary artery visualization.A，B，C and D represent anterior descending branch，circumflex branch，anterior descending branch and circumflex branch，and right coronary artery branch stenosis，respectively.图1 冠脉造影代表性结果

Figure 2. Electropherogram of the three genotypes of MMP－2 after cleavage. Lane 1:DNA marker;Lane 2:CC type;Lane 3:CT type;Lane 4:TT type.图2 3 种基因型MMP－2 PCR 产物酶切后的电泳图谱

3 不同基因型与CAS 组和冠脉病变程度之间的关系

如表2 所示，CAS 组与对照组CC 基因型频率分别为86.1%和79.7%，CT +TT 基因型频率分别为13.9%和20.3%，两组差异显著(χ2=4.398，P ＜0.05);C 等位基因频率在CAS 组和对照组分别为92.6% 和89.1%，T 等位基因频率为7.4% 和10.9%，两组差异显著(χ2=4.521，P ＜0.05)。从表3 可见，MMP－2 基因-735C→T 多态性对冠脉狭窄程度无明显影响(χ2=1.553，P ＞0.05)。在CAS 组和对照组，MMP－2 基因-735C→T 多态性分布，经χ2检验均符合Hardy -Weinberg 平衡，表明受检者来自同一群体。

表2 MMP－2 三种基因型和等位基因频率在CAS 和对照组中的分布Table 2. Distribution of the three genotypes and allele frequences of MMP－2 in CAS group and control group

表3 MMP－2 三种基因型与CAS 病变程度的影响Table 3. Effect of the three genotypes of MMP－2 on CAS

讨 论

有研究表明，在冠状动脉硬化患者中血浆中MMP-2 含量明显升高，MMP-2 与粥样斑块的形成和发展有密切的关系［6，10，11］。MMP -2 又称明胶酶A，是MMPs 家族的主要成员，因其作用底物是构成血管壁基质和基底膜的主要成分，因此，MMP -2 在冠状动脉粥样硬化斑块形成和血管重构中的作用受到研究者的重视［2，3，6，12，13］。关于CAS 斑块组织及患者血浆中MMP -2 水平升高的原因，一则可因斑块组织受细胞因子刺激使MMP－2 基因表达活性升高而引起，二则可因MMP－2 基因，(尤其是表达调控区)突变所致。

本文以309 例经冠脉造影确诊为CAS 的患者为研究对象，对MMP－2 基因启动子区C -735T 进行检测。结果提示，CAS 患者较对照组C 等位基因频率偏高而T 等位基因频率偏低，CC 基因型CAS 发病率较高，而CT+TT 基因型发病机率较低。以往的研究报道，MMP－2 基因启动子区存在C -735T 基因多态性［6，7］，这一多态性位点正好位于转录因子Sp1结合的顺式作用元件区域，从而可影响Sp1 与其顺式元件相互作用及MMP－2 基因的转录活性。本文结果提示，-735C→T 基因突变可能通过改变Sp1与顺式作用元件的结合上调MMP -2 表达，而使基底膜和细胞外基质降解加强，造成血管平滑肌细胞向内膜迁移，并吞噬脂质形成泡沫细胞，加速粥样斑块的形成。但实验结果还提示，MMP－2 基因-735-T 多态性与冠状动脉狭窄程度无关，原因之一，可能是由于在病变晚期细胞外基质的形成和降解趋于平衡，掩盖了基因型的影响;原因之二，MMP－2 基因突变可上调MMP -2 表达，加速基底膜和细胞外基质降解，有利于泡沫细胞在血管壁的聚集及动脉粥样斑块的形成，而这一机制在动脉粥样斑块形成的早期发挥的作用较明显。在病变晚期MMP -2 的高表达，一方面，降解血管壁细胞外基质促进动脉粥样斑块的形成;另一方面，在降解血管壁细胞外基质的同时，也降解动脉粥样斑块内的细胞外基质使斑块趋于减小，因此掩盖了基因型对冠脉狭窄程度的影响所致。我们下一步将对确诊的CAS 病例进行分期，从而进一步明确MMP－2 启动子区C -735T 多态性与冠脉狭窄程度的关系。

总之，本研究结果提示，MMP－2 基因C -735T多态性与中国汉族人群CAS 有关，MMP－2 基因-735 bp的C 等位基因可能是CAS 遗传易感性的基因标记之一;MMP－2 基因C -735T 多态性与CAS冠脉狭窄程度无关。本实验还存在一些不足之处，如样本量偏小。因此，继续收集临床病例扩大样品量，继续对本研究对象进行随访，尤其是对PTCA 术后再狭窄患者基因型的研究将有助于进一步了解MMP－2 基因多态性与CAS 的关系。

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