树舌灵芝液体深层发酵菌丝体化学成分研究

刘英杰，李雨婷，苏 玲，宋 慧，薛 强

(1.吉林农业大学生命科学学院，吉林 长春 130118;2.河南科技学院，河南 新乡 453003)

树舌灵芝［Ganoderma lipsiense(Batsch)G.F.Atk.，Syn.G.applanatum(Pers.)Pat.;Elfvingia applanata(Pers.)Karst.］为灵芝科(Ganodermataceae)、灵芝属(Ganoderma Karst.)高等真菌。迄今为止，已从树舌灵芝子实体中分离得到糖类［1］、甾体化合物［2］、三萜类［3］、脂类［4］、有机酸、生物碱类、氨基酸、多肽、酚类、内酯、香豆素类、苷类和挥发油以及微量元素等物质［5］，多种化学成分使其具有广泛的生物活性。

液体深层发酵是目前工厂化生产药用真菌的主要手段，目前，尚未见对树舌灵芝发酵菌丝体化学成分研究的报道。鉴于此，本研究以工业化生产的树舌灵芝液体深层发酵菌丝体为材料，对其化学成分进行系统研究，以便更好地开发这一药用真菌资源。

1 材料

树舌灵芝液体深层发酵菌丝体由白求恩医科大学制药厂提供。

Agilent 6010紫外分光光度计(安捷伦);红外分光光度计FTIR-8400s(岛津);Varian INOVA-400型核磁共振波谱仪。

2 方法

树舌灵芝液体深层发酵菌丝体粉末用95%乙醇50℃回流24 h，过滤，重复三次，合并滤液，减压浓缩回收乙醇，浓缩液置于冰箱中静止24 h，离心，获得沉淀和上清液。所得的沉淀和上清液通过硅胶柱层析和大孔吸附树脂层析进行进一步分离，最后获得单体化合物。具体流程见图1。

图1 树舌灵芝液体深层发酵菌丝体化学成分提取分离流程图Fig.1 Extraction and isolation of the compounds from submerged fermentation mycelium of Ganoderma lipsiense

3 结果

3.1 化合物A

白色针状晶体，易溶于氯仿等有机溶剂，不溶于水。熔点156～159℃，TLC(薄层色谱)展开后碘显色，呈黄棕色斑点，喷洒5%乙醇浓硫酸显紫色斑点。

红外光谱中，2 957 cm－1为=C-H伸缩振动，2 871 cm－1为饱和C-H伸缩振动吸收，1 657和1 460 cm－1为共轭双键C=C伸缩振动，1 373 cm－1为甲基C-H对称弯曲振动。

13C-NMR波谱给出了27个碳原子信号，13CNMR(CDC3)中 δ141.32，139.77，135.56，131.98，119.58，116.29 提示分子中有三个双键。1H-NMR(CDCl3)显示有四个烯氢信号:δ5.574(1H，dd，J=5.5，2.8 Hz)，5.384(1H，ddd，J=5.5，2.8，2.5 Hz)，5.220(1H，dd，J=15.3，7.4 Hz)，5.172(1H，dd，J=15.3，8.3 Hz)。δ5.220 与5.172 氢有一个同样的偶合常数15.3 Hz，大于12 Hz，说明这是双键的两个反式氢，而另一对偶合常数分别是7.4 Hz和8.3 Hz，说明这个双键处于侧链上。1H-NMR谱中δ3.636(1H，m)为甾醇的三位α 氢信号。δ1.029(3H，d，J=6.6 Hz)，0.948(3H，s)，0.910(3H，d，J=6.9 Hz)，0.833(3H，d，J=6.8 Hz)，0.799(3H，d，J=6.6 Hz)，0.632(3H，s)提示分子中有 6 个甲基。其波谱数据与文献［6］中报道的麦角甾醇基本一致，故将该化合物定为麦角甾醇。

3.2 化合物C

无色针状晶体，易溶于水，微溶于甲醇，不溶于有机溶剂，熔点166～168℃，Molish反应呈阳性。取本品饱和水溶液少许，加入三氯化铁试液与氢氧化钠试液，即生成棕黄色沉淀，震摇不消失;滴加过量的氢氧化钠试液，既溶解成棕色溶液。

红外光谱在3 400，3 288 cm－1有缔合羟基存在，2 985 cm－1有-CH2-对称伸缩振动，1 420 cm－1有-CH-面内弯曲振动，1 282 cm－1有-OH基团面内弯曲振动，1 081 cm－1有仲醇 C-O 伸缩振动，1 020 cm－1有伯醇C-O伸缩振动，631 cm－1有-CH-面外弯曲振动。

1H-NMR 图谱化学位移 δ=2.495、δ=2.500、δ=2.504、δ=3.312、δ=3.362、δ=3.376、δ=3.389、δ=3.403、δ=3.446、δ=3.460、δ=3.468、δ=3.532、δ=3.542、δ=3.561、δ=3.595、δ=3.603、δ=4.111、δ=4.128、δ=4.289、δ=4.303、δ=4.317、δ=4.384、δ=4.398。红外光谱与1H-NMR图谱通过与甘露醇对照品图谱相对照，结合化学检测确定该化合物为甘露醇。

3.3 化合物D

易溶于水，微溶于甲醇，不溶于有机溶剂，熔点120～123℃，Molish反应呈阳性。

紫外光谱扫描，吸收峰在210 nm波长附近，近紫外区无吸收，红外光谱在3 263.63 cm－1有一强特征吸收，符合碳水化合物中的-OH基在3 800～3 200 cm－1之间的伸缩振动。化合物D红外图谱的OH基团的特征吸收谱带强而宽。

1H-NMR 化学位移:δ=1.136、δ=1.153、δ=1.170、δ=3.325、δ=3.592、δ=3.620、δ=3.647、δ=3.733、δ=3.760。1H-NMR 化学位移:δ1=3.522(1H d J=4.8 Hz)、δ2=3.541(1H d J=3.6 Hz)、δ3=3.580(1H d J=4.8 Hz)、δ4=3.665(1H s)、δ1=3.684(1H s)。从分析化学手册［7］可知，脂肪醇烷基H的化学位移:连有OH基团的C上的Hδ=3.39～3.94，其中-CH2OHδ=3.59，-CHOHδ=3.94，五元环中H-C-C-H的偶合常数J(1.2±5.1)。

13C-NMR 化学位移:δ=64.325、δ=73.630。根据13C-NMR谱图中只有两个化学位移峰，结合红外光谱推断化合物C含有4碳4羟基的具有对称结构的赤藓糖醇。

3.4 化合物E

白色针状晶体，易溶于氯仿等有机溶剂，不溶于水。熔点156～159℃，TLC展开后碘显色，呈黄棕色斑点，喷5%乙醇浓硫酸显紫色斑点。Lieberman-Burchard反应呈阳性，Salkowshi反应呈阳性，提示该化合物为甾醇类化合物。

与化合物A的TLC比较，二者在三种不同系统展开剂:氯仿-甲醇(8∶1)、环己烷-乙酸乙酯(3∶2)和苯-丙酮(7∶2)中 Rf值都相同，分别为0.41，0.44 和0.47。

与化合物A的1H-NMR和13C-NMR波谱谱图比较，数据基本吻合，因此确定化合物E与化合物A相同，为麦角甾醇。

4 讨论

赤藓糖醇为首次从树舌灵芝液体深层发酵菌丝体中被分离得到，在树舌灵芝子实体中也未见报道，由于其具有重要的药理活性及化工用途［8-11］，本研究所得结果对树舌灵芝菌丝体的开发应用具有重要的意义。但是，研究未涉及对赤藓糖醇的提取工艺及树舌灵芝液体深层发酵条件的研究，今后可开展相关工作为树舌灵芝液体深层发酵菌丝体的应用奠定坚实的基础。

本研究中，在两种分离途径中都分离获得了麦角甾醇单体化合物A和E，而且化合物A的分离方法更简单、易操作。根据麦角甾醇的理化性质，采用高温提取，低温、低醇的分离方法对其进行分离，是快速提取麦角甾醇的可行方法。

本研究表明通过吸附树脂色谱结合TLC、薄层制备的方法可获得甘露醇晶体，但是在薄层制备的过程中由于色谱时间较长，增加了分离的时间，若在纯化的过程中结合现代分析制备仪器将能更快地获得甘露醇的晶体。

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［2］Smania J A，Delle M F，Smania E F A.Antibacterial activity of steroidal compounds isolated from Ganoderma applanatum(Pers.)Pat.(Aphylloph-oromycetideae)fruit body［J］.Int J Med Mushrooms，2003，5:31-35.

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［4］Endoh S，Kaneko H，Mitsuhashi T.Lipids of five species of polyporaceae(Pyellinus robustrs，Fomitopsis cytisina，Grifola frondosa，Elfyingia applanata and Coriolus versicolor)［J］.Shizen Kagaku，1981，33:139-142.

［5］佟丽华，回景芳，杨 波，等.树舌灵芝中化学成分的研究［J］.佳木斯医学院学报，1989，12(4):342-344.

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［7］于德泉，杨峻山.分析化学手册-核磁共振波谱分析［M］.北京:化学工业出版社，1999:65.

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