高效液相色谱法测定辅酶Q10冻干乳在大鼠体内血药浓度及其初步药动学研究

冯秀珍，丁燕飞，丁劲松，姚 瑶

(1.中南大学 药学院，湖南 长沙 410013;2.湖南省常德市药品检验所，湖南 常德 415000)

辅酶Q10是广泛存在于各类细胞中的脂溶性类维生素物质，是人体内不可缺少的内源性物质，临床上广泛应用于心肌梗死、慢性或充血性心力衰竭、高血压、糖尿病、帕金森病、癌症及艾滋病等的辅助治疗［1］。辅酶Q10冻干乳剂是可供注射用的新剂型，具有载药量大、稳定、便于贮存运输等优点［2-4］。本实验建立测定大鼠体内辅酶Q10血药浓度方法，并对辅酶Q10冻干乳在大鼠体内药动学作初步研究。

1 材料

辅酶Q10对照品(中国药品生物制品检定所，批号:611-200102);辅酶Q10冻干乳(中南大学药剂教研室制备);维生素K1(安徽万和制药有限公司);无水乙醇、甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

SHIMADZU LC-2010AHT型高效液相色谱仪、UV/Vis检测器、Lc-solution工作站(日本岛津)。

Wastar大鼠，雄性，上海斯莱克实验动物有限公司，许可证号:SCXK(沪)2007-005。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Hypersil BDS C18柱(4.6 mm×200 mm，5 μm);流动相:甲醇 － 无水乙醇(30∶70);柱温30℃;检测波长:275 nm;进样量:20μL。内标为含约1.5μg/mL维生素K1的无水乙醇溶液。

2.2 给药方案及大鼠血样采集

取健康成年Wastar大鼠12只，雄性，随机分配成2组(冻干乳组、空白组)，每组6只，实验前禁食12 h，自由饮水，按0.8mg/kg剂量尾静脉注射给药，于给药前和给药后0.125，0.25，0.5，1，2，4，8，12，24 h眼眶静脉取血约250μL，3 000 r/min离心2 min，取血浆于－20℃保存。每取4个时间点血样，灌胃给予大鼠生理盐水2mL，以保持血容量。

2.3 对照品溶液的配制

精密称取辅酶Q10对照品9.87mg，加无水乙醇溶解并稀释至100mL，得对照品贮备液。再用无水乙醇稀释成含辅酶 Q100.17，0.33，0.67，1.34，2.68，5.36，10.73和21.46 μg/mL 的系列标准溶液。

2.4 血浆样品处理

取血浆100μL，加入内标溶液50μL，30℃水浴吹干，加萃取液［正已烷-无水乙醇(8∶1)混合液］4mL，涡旋混合60 s后2 000 r/min离心5 min，吸取上层萃取液3.0mL于离心管中，置30℃水浴上吹干，加无水乙醇100μL溶解即得。

2.5 方法专属性

取2.4项下处理好的空白大鼠血浆样品、空白大鼠血浆加对照品及内标样品、给药后的大鼠血浆样品以及含对照品和内标的溶液分别进样，记录色谱图，结果表明辅酶Q10及内标与血浆中杂质分离良好，内源性物质不干扰测定，结果见图1。

2.6 线性范围和定量下限

分别取辅酶Q10系列标准溶液100μL，加入空白血浆100μL后，按2.4项下自加入内标起操作并进样，以辅酶Q10峰面积与内标峰面积之比R为纵坐标，辅酶Q10浓度C为横坐标绘制标准曲线，得标准曲线回归方程:R=1.365 7 C+0.029 4(r=0.999 8，n=6)。最低定量浓度为0.17 μg/mL，RSD(n=6)为5.35%。

2.7 萃取回收率

分 别取2.3项下含辅酶Q105.3 6，1.34，0.33μg/mL的标准溶液各5份，每份取100 μL，加入空白血浆100μL后，按2.4项下自加入内标起操作;同时取上述相同浓度辅酶Q10标准溶液加入内标溶液，不经萃取直接氮气吹干，用前加100μL无水乙醇溶解。分别进样，计算辅酶Q10与内标的回收率。3种浓度血浆样品辅酶Q10的萃取回收率分别为:(92.09±2.59)%，(89.39±2.38)%，(93.80±1.46)%(n=5);内标的萃取回收率分别为(93.27±1.41)%，(94.56± 2.69)%，(95.16± 1.42)%(n=5)。结果表明辅酶Q10与内标萃取回收率较高且差别不大，符合血样测定要求。

图1 高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatograms

2.8 方法回收率和精密度

取含辅酶 Q105.36，1.34，0.33 μg/mL 的标准溶液，加入空白血浆100μL后，按2.4项下自加入内标起同法操作，每个浓度各配制5份，连续测定5 d，计算回收率及日内、日间精密度。3种浓度血浆样品辅酶Q10的回收率分别为:(102.0±8.86)%，(102.6±5.28)%和(97.8±3.79)%(n=5)，方法精密度见表1。

2.9 稳定性考察

将含辅酶 Q105.36，1.34，0.33 μg/mL 的血样于－20℃放置，冷冻-融化循环3次，实验中均无明显降解。将3种浓度的辅酶Q10血样配制后放置12 h内稳定。将3种浓度的辅酶Q10血样－20℃放置10 d后，辅酶Q10浓度变化不大，浓度测定结果的RSD均小于7%。

表1 精密度测定结果(n=5)Tab.1 Result of intra-day and inter-day precision(n=5)

图2 注射给药后辅酶Q10平均血药浓度-时间曲线Fig.2 Mean plasma concentration-time curve of CoQ10 in rats after iv coenzyme Q10 in lyophilized emulsion

2.10 血浆样品测定及初步药动学测定结果

12只大鼠按2.2项下给药及采集血样后，再按2.4项下处理，进样分析，测得平均血药浓度-时间曲线见图2。

血药浓度-时间数据利用DAS 2.1.1版药动学分析软件处理。结果表明，静注辅酶Q10冻干乳后辅酶Q10在大鼠体内的药动学行为符合二室开放模型。求得药动学参数如下:t1/2α为(0.15±0.04)h，t1/2β为(6.31±2.84)h，K10为(0.84±0.15)h－1，K12为(3.90± 1.83)h－1，K21为(0.39± 0.65)h－1，AUC0－24为(22.80±5.42)(μg·h)/mL，AUC0－∞为(26.82±6.70)(μg·h)/mL。

3 讨论

6只空白大鼠与制剂同时间点取样，同法测定各取样时间点内源性辅酶Q10浓度，在各时间点均未检测出明显内源性辅酶Q10。大鼠血浆中主要含辅酶Q9［5］，空白内源性辅酶Q10的量本实验方法灵敏度范围内未检出，因此实验中未考虑内源性辅酶Q10的影响。

有报道，萃取时分别加入无水乙醇及正已烷，然后进行萃取操作［5］，本实验将无水乙醇及正已烷按比例混合后一次加入，减少操作步骤，同时经比较两种方法测定结果没有明显差异。

选用正已烷-无水乙醇为萃取溶剂［6］，考察了不同比例(5∶1，6∶1，7∶1，8∶1，9∶1，10∶1，11∶1，12∶1)的萃取效果。结果表明，无水乙醇比例增加，萃取效率提高，但乳化严重，管壁上固体物多，正已烷层与醇水混合层界面不清晰。当大于9∶1时，萃取效率急剧下降，8∶1时萃取效率最高，油水界面最清晰，不发生乳化。因此选择正已烷-无水乙醇(8∶1)为萃取溶剂。

文献报道测定辅酶Q10血样时采用辅酶Q9作为内标［7］，因大鼠血中含内源性辅酶Q9，干扰测定，我们选用维生素K1作为内标，测定结果良好，内标放置稳定，处理过程中不降解。

由于辅酶Q10脂溶性强、乳剂可被动靶向于含巨噬细胞丰富的组织如肝、脾、淋巴等器官，因此辅酶Q10冻干乳注射给药后快速分配，t1/2α较小。

［1］钱 雪，王祖巧，韩国平.辅酶Q10的药理与应用［J］.食品与药品，2006，8(1):16-19.

［2］丁燕飞，姚 瑶，陶昱斐，等.辅酶Q10亚微乳注射剂的制备及其性质研究［J］.中南药学，2007，5(5):448-451.

［3］冯秀珍，姚 瑶，丁燕飞，等.高效液相色谱法测定注射用辅酶Q10冻干乳含量及有关物质［J］.中南药学，2008，6(3):298-230.

［4］李玉林，董 志，彭 力，等.辅酶Q10冻干乳剂的研究［J］.中国生化药物杂志，2009，30(5):305-308.

［5］Ernster L，Dallner G.Biochemical，physiological and medical aspects of ubiquinone function［J］.Biochim Biophys Acta，1995，1271(1):195-204.

［6］肖淑华，魏广力，陆 榕，等.辅酶Q10片的人体生物利用度研究［J］.中国临床药理学与治疗学，2000，5(1):39-41.

［7］张伟英，李士敏，王彤文，等.辅酶Q10片药动学与人体相对生物利用度试验［J］.中国医院药学杂志，2004，24(9):257-259.