HPLC法测定益精灵口服液中二苯乙烯苷的含量

赖 艳，温 悦，贝莹珽，傅正毅，孟德胜#(.第三军医大学第三附属医院药剂科，重庆 40004;.重庆医科大学药学院，重庆 40006;.蚌埠医学院，蚌埠 000)

益精灵口服液主要含何首乌、补骨脂等中药，有健脑安神、滋补肝肾、调节内分泌及预防感冒等作用，同时对无眠多梦、健忘、腰酸膝软、神疲乏力及更年期综合征也有良好的疗效，其中2，3，5，4'-四羟基二苯乙烯-2-Ο-β-D-葡萄糖苷(简称二苯乙烯苷)为何首乌的主要成分之一。为了控制该药的质量，本实验采用高效液相色谱法测定制剂中主药何首乌所含有效成分二苯乙烯苷的含量，为该制剂的质量控制提供有效、可行的方法。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1200系列高效液相色谱仪(美国安捷伦公司);Sartorius BT 25S电子分析天平(德国赛多利斯);SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司);KQ-50B型超声波清洗仪(昆明市超声仪器有限公司)。

1.2 试药

二苯乙烯苷对照品(批号:110844-200908，中国药品生物制品检定所);益精灵口服液;甲醇和乙腈为色谱纯;水为超纯水;其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Diamonsil C18(250 ×4.6 mm，5 μm);流动相:乙腈-水(22∶78);柱温:25℃;检测波长:320 nm;流速:1.0 mL·min－1;进样量:10 μL。

2.2 溶液配制

2.2.1 对照品溶液的配制:精密称取二苯乙烯苷标准品1.6 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得到浓度为160 μg·mL－1二苯乙烯苷溶液作为对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的配制:精密量取益精灵口服液2 mL，置于50 mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，再用甲醇按1∶1稀释，摇匀，用0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。

2.2.3 阴性对照品的配制:按益精灵口服液处方比例取缺何首乌药材制成溶液，再按照“2.2.2”项下的方法制成阴性对照品溶液，备用。

2.3 方法学实验

2.3.1 系统专属性实验:分别取供试品溶液、对照品溶液、阴性对照品溶液各10 μL按“2.1”项下的色谱条件进样，记录色谱图。二苯乙烯苷对照品色谱的保留时间约为10 min，供试品中的二苯乙烯苷与其他杂质分离度良好，分离度大于1.5，保留时间约为10 min，阴性对照品色谱在二苯乙烯苷相应位置处无干扰，见图1。

图1 高效液相色谱图 Fig1 HPLC chromatograms

2.3.2 线性关系考察:精密吸取对照品溶液置10 mL棕色容量瓶中，配制得9个不同梯度的对照品溶液(0.625、1.25、2.5、5、10、20、40、80、160 μg·mL－1)，依次精密进样10 μL，在“2.1”项下的色谱条件进样分析。以峰面积(A)为纵坐标，浓度(C)为横坐标(μg·mL－1)，进行线性回归，得回归方程:A=31.75C －3.56，(r=0.999 9，n=9)。结果表明:二苯乙烯苷浓度在0.625～160 μg·mL－1范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.3.3 精密度实验:取高(160 μg·mL－1)、中(10 μg·mL－1)、低(0.625 μg·mL－1)3个浓度的对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件于1 d之内连续进样5次，以及连续3 d分别进样，计算各成分浓度的RSD，进行日内精密度和日间精密度考察，结果日内精密度RSD＜1.91%(n=5)，日间精密度RSD＜2.97%(n=3)。

2.3.4 重复性实验:取同一批号(批号:20100622)的益精灵口服液平行试验6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样。结果二苯乙烯苷的平均含量为10.52 μg·mL－1，RSD 为 1.69%。

2.3.5 稳定性实验:取本品按上述供试品溶液制备方法制备，制备后分别放置0、5、10、20 h，按“2.1”项下色谱条件进样，测定峰面积。RSD=2.24%，表明供试品溶液在20 h内基本稳定。

2.3.6 加样回收率实验:精密称取9份已知含量的益精灵口服液，每3份为1组，每组分别精密加入浓度为850 μg·mL－1的二苯乙烯苷对照品溶液2.0、1.0、0.5 mL，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，计算加样回收率，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果(n=9)Tab1 Results of recovery test of samples(n=9)

2.3.7 样品含量测定:取益精灵口服液样品(批号:20100622、20100928、20101215，)，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，共3次，计算得益精灵口服液样品中二苯乙烯苷的含量分别为 10.23、9.88、8.38 μg·mL－1，RSD 值分别为 1.34%、2.21%、1.58%(n=3)。

3 讨论

何首乌为益精灵口服液的主药。现代药理研究证明［1］，何首乌具有抗衰老、降血脂以及免疫、护肝等作用，何首乌中二苯乙烯苷类成分具有广泛的心血管活性、免疫调节、保肝等作用。《中华人民共和国药典》对何首乌及其炮制品制何首乌采用了指标性成分二苯乙烯苷的含量高低作为质量控制的依据［2］。本实验对象二苯乙烯苷对光不稳定，因此在配制时采用避光操作，并使用棕色容量瓶，供试品溶液也选择在临用前新配制。实验色谱柱曾选用 Diamonsil C18(250×4.6 mm，5 μm)和 Agilent C18(250 ×4.6 mm，5 μm)，流动相均为乙腈-水［2］，检测波长为320 nm。结果两种色谱柱分离度均很好，系统适应性较好，保留时间在8～15 min。两种种色谱柱所得供试品含量结果均在误差范围内，说明该含量测定的耐用性较好。在样品测定中，最后选择Diamonsil C18色谱柱。流动相曾采用乙腈-水、甲醇-水［3，4］、乙腈-0.1% 甲酸、乙腈-0.1% 磷酸［5］体系，乙腈-水体系，柱效较高且分离度好且保留时间合适。在多个流动相比例中，最后确定乙腈∶水=22∶78，作为流动相，样品的保留时间较为合适，分离度良好，阴性对照没有干扰。

本实验应用高效液相色谱法建立了益精灵口服液中二苯乙烯苷的含量方法。测定益精灵口服液中的二苯乙烯苷的含量为10.52 μg·mL－1，本实验所建立的测定方法，简单可行，结果准确可靠，可有效的控制益精灵口服液的质量。

［1］苏 玮，郭 群.何首乌的现代药理研究概况［J］.中草药，1997，28(2):119.

［2］国家药典委员会.中华人民共和国药典:一部［S］.2010年版.北京:中国医药科技出版社，2010:954.

［3］陈 瑾，侯世祥.HPLC法测定参芪补肾口服液中2，3，5，4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D 葡萄糖苷的含量［J］.中国实用医药，2009，4(28):14.

［4］刘敏华.高效液相色谱法测定升血调元汤中二苯乙烯苷的含量［J］.医药导报，2010，29(12):1636.

［5］周 涛，江维克.HPLC法测定益视口服液中二苯乙烯苷的含量［J］.中国药房，2009，20(6):450.