黄芪经侧耳菌发酵后多糖成分及含量的变化

陈丽艳，李 月，张 迎，金 爽，方自若，王伟明

（黑龙江省中医研究院，黑龙江哈尔滨150036）

黄芪经侧耳菌发酵后多糖成分及含量的变化

陈丽艳，李 月，张 迎，金 爽，方自若，王伟明*

（黑龙江省中医研究院，黑龙江哈尔滨150036）

以黄芪作为"药性基质"，在一定的条件控制下，运用双向发酵技术，经侧耳菌发酵，生成黄芪"药性菌质"，比较黄芪发酵后多糖成分及含量的变化。采用琼脂糖凝胶电泳法对黄芪发酵前后多糖进行定性鉴别，并用蒽酮-硫酸法测定其含量。黄芪发酵前后多糖的琼脂糖凝胶电泳呈一个均一斑点，迁移率分别为0.98和1.21。黄芪发酵前后多糖得率分别为6.31%和9.50%，含量分别为2.12%和3.64%。结果表明，琼脂糖凝胶电泳法可用于黄芪发酵后多糖的定性鉴别，黄芪经侧耳菌发酵后多糖提取率及含量均明显增加，充分体现了中药发酵可以使其活性成分较大限度释放的优点。

黄芪，侧耳菌，发酵，多糖

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

侧耳菌（Pleurotus ostreatus） 由黑龙江省科学院应用微生物研究所提供，菌丝体白色，气生菌丝浓密；黄芪 购自安徽沪谯中药科技有限公司，由黑龙江省中医研究院付克志研究员鉴别为膜荚黄芪，粉碎后过40目筛，水分11.16%；葡萄糖 天津市博迪化工有限公司，分析纯；琼脂糖 北京奥博星生物技术有限责任公司，分析纯；甲苯胺蓝 国药集团化学试剂有限公司，分析纯；四硼酸钠 天津市东丽区东大化工厂，分析纯。

DYY-12型电泳仪、DYCP-31D型电泳槽 北京市六一仪器厂；高压灭菌锅 上海三申医疗器械有限公司；HZQ-X100振荡培养箱 中国哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；GJ75培养箱 齐齐哈尔市医汞电子器械厂；LG10-2.4A离心机 北京医用离心机厂；UV-160A紫外分光光度计 日本岛津。

1.2 实验方法

1.2.1 菌质的培养 将保存的侧耳菌菌种接种到常规CPDA培养基上，28℃恒温培养10d，使菌丝发育良好，备用。液体培养基：马铃薯浸汁20%，葡萄糖2%，硫胺素0.001%，KH2PO40.3%，MgSO4·7H2O 0.15%。将传代后发育良好的菌丝接种至经灭菌过的液体培养基内，28℃、140r/min摇瓶培养7d，要求菌球颗粒大小适当，发酵液澄清。

药性基质培养基：黄芪83%，麦麸15%，CaCO31%，CaSO41%，水100%（按发酵基质干重）。将料拌匀，分装入袋，121℃灭菌40min。

1.2.2 固体发酵 将液体种子接种入灭菌后的药性基质培养基中，置于恒温培养箱于28℃静止培养40d，取出干燥得黄芪药性菌质。同时设一对照即药性基质培养基，不接种侧耳菌。

1.2.3 多糖的提取 称取黄芪药性菌质、对照组及黄芪药材各100g，加蒸馏水800mL,在80℃水浴浸提2h，提取3次，合并水提液，离心，上清液浓缩至100mL，加95%乙醇至含醇量为30%，静置12h，减压抽滤，上清液加95%乙醇至含醇量为80%，静置12h，减压抽滤，分离出沉淀用无水乙醇洗涤多次，低温干燥，即得相应多糖粗提物Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ。重复3次，计算得率。

1.2.4 琼脂糖凝胶电泳

1.2.4.1 试剂的配制 电极缓冲液：0.05mol/L硼砂缓冲液，pH9.3；染色剂：0.06%甲苯胺蓝溶于0.5%醋酸中；指示剂：0.1%溴酚蓝溶液；0.2%肝素，样品多糖均用蒸馏水配成10mg/mL的溶液。

1.2.4.2 电泳鉴别 将1.0%的琼脂糖凝胶加热溶解后倒入电泳板中制成3～5mm厚的胶板。各供试品溶液于负极点样，点样量为l0μL，置电泳槽中，加入电极缓冲液，固定电压110V，电流85mA，功率15W，电泳50min后，0.06%甲苯胺蓝染色10min，用流水冲洗1h脱色，待背景颜色清晰即可[5-6]。脱色后，计算各样品的电泳迁移率。

1.2.5 多糖的含量测定[7]

1.2.5.1 对照品溶液的配制 精密称取干燥至恒重的葡萄糖对照品20mg，加蒸馏水溶解，定容于100mL容量瓶中，配成0.2g/L的葡萄糖标准溶液。分别精密吸取标准液1、2、3、4、5mL置于10mL容量瓶中，以蒸馏水定容摇匀，得系列对照品溶液。

1.2.5.2 蒽酮-浓硫酸溶液的配制 称取0.2g蒽酮，加100mL浓硫酸，置于棕色瓶中，混合摇匀置于冰箱中（现配现用）。

1.2.5.3 最大吸收波长的确定 以水为空白对照，取葡萄糖标准溶液与蒽酮-硫酸显色后，于500～700nm波长范围内扫描，测得最大吸收波长为620nm。

1.2.5.4 葡萄糖标准曲线的绘制 精密吸取上述系列对照品溶液1.0mL，分别置于10mL具塞试管中，将试管置于冰水中，在冰水中分别向试管中加入0.2%蒽酮-硫酸溶液4mL，待各管加完后同时摇匀，置于沸水浴中加热10min，取出用冷水迅速冷却至室温，放置10min，于620nm处测定吸光度。另精密吸取蒸馏水1.0mL，同法操作，作为空白对照。以葡萄糖浓度C（g/L）为横坐标，吸光度A为纵坐标绘制标准曲线。

1.2.5.5 样品溶液的制备 精密称取样品多糖粗提物Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ各10mg，加水溶解并定容至100mL量瓶中，得相应的样品溶液。

1.2.5.6 样品溶液多糖含量的测定 精密吸取各样品溶液1.0mL，于10mL具塞试管中，测定吸光度。实验重复3次，计算样品多糖的含量。

2 结果与讨论

2.1 电泳结果

黄芪发酵后多糖在琼脂糖凝胶上呈单一斑点，斑点位置与其他对照组多糖的斑点位置也有明显区别，肝素、样品多糖Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ与指示剂相比，电泳迁移率依次为1.08，1.21，0.56，0.98。见图1。

图1 黄芪发酵前后多糖的琼脂糖凝胶电泳图谱注：1-溴酚蓝指示剂；2-肝素；3-样品多糖Ⅰ；4-样品多糖Ⅱ；5-样品多糖Ⅲ。

以琼脂糖凝胶作为电泳介质，一般按供试品的电荷密度及分子质量进行分离，而电泳迁移率的大小主要由供试品自身所带电荷的多少决定[8]。黄芪经侧耳菌发酵后多糖的电泳迁移率为1.21，未发酵的黄芪药材为0.98，表明黄芪发酵后多糖电荷量有所增加。尽管琼脂糖凝胶浓度、厚度，缓冲液pH及供试品的点样量等因素对电泳结果均有影响，但其相对迁移率都很稳定，说明该方法可用于多糖的定性鉴别。

2.2 葡萄糖标准曲线

以葡萄糖为标准品制定标准曲线，得回归方程为Y=7.205X+0.1061，相关系数r=0.9995。表明在20～100μg范围内葡萄糖的含量与吸光度呈良好线性关系，见图2。

图2 葡萄糖溶液标准曲线

2.3 精密度实验

取0.06g/L葡萄糖对照品溶液，重复测定5次，求得其RSD为2.32%（n=5），精密度良好。

2.4 稳定性实验

精密吸取黄芪药性菌质多糖溶液，显色后每隔0.5h测定一次吸光度，连续4h考察其稳定性。结果吸光度基本无变化，表明样品溶液显色后4h内稳定性良好。

2.5 重复性实验

取多糖粗提物Ⅰ，称取5份，制备样品溶液进行含量测定。RSD为1.93%（n=5）。结果表明，本方法重复性良好。

2.6 回收率实验

取黄芪药性菌质多糖溶液，加入一定量的葡萄糖标准溶液,混匀后取1.0mL置于具塞试管中，测定吸光度，计算回收率。结果平均回收率为102.3%，RSD为2.85%（n=5）。

2.7 多糖的得率及含量的测定结果

黄芪经侧耳菌发酵后，多糖得率及含量均有明显的提高，结果见表1。

表1 多糖的得率及含量测定结果（%，n=3）

由表1可知，黄芪原药材（Ⅲ）的多糖得率及含量分别为6.31%和2.12%,对照组（Ⅱ）分别为6.44%和2.56%,对照组多糖的得率和含量稍高于原药材，是因为灭菌过程中高温蒸汽使细胞壁产生径向收缩应力，一定程度上破坏了黄芪细胞壁的完整性或者大大提高了细胞壁的通透性，使得多糖更易溶出。而发酵后黄芪（I）多糖得率和含量明显提高，得率为9.50%，与对照组相比高出47.5%，差异显著（P＜0.05），多糖含量达到3.64%，与对照组相比高出42.2%，差异极显著（P＜0.01）。这可能是由于黄芪中含有大量木质素和纤维素，为侧耳菌的生长提供了营养基质，诱导侧耳菌产生大量木质素酶和纤维素酶，分解黄芪的细胞壁，促使黄芪多糖从细胞壁或者蛋白复合体中游离出来。

黄芪多糖是黄芪的主要活性物质之一，具有增强机体免疫功能、强心、降压等多种药理功效[9]。多糖是理想的免疫增强剂，而且对正常细胞没有毒副作用。由于黄芪多糖的多种生物活性及良好的临床效果,多年来在国内外已成为中药提取及中草药现代化研究的焦点之一[10-11]。但传统水提醇沉法黄芪多糖得率一直不高,导致中药资源的浪费和成本的增高，李红民等[12]采用水提取法得到黄芪得率为3.6%，刘瑞生等[13]采用水提取法黄芪多糖得率为3.6%～4.0%，CaO溶液提取法黄芪多糖得率为5.9%～7.75%,虽有提高但酸碱法提取多糖作用较强烈,多糖活性无法保证。本研究首次选用侧耳菌发酵黄芪，使多糖的得率及含量达到9.50%和3.64%，与已往文献报道的其它方法提取黄芪多糖的得率及含量相比，有较大辐度的提高，从而使其生物活性得以提高。

3 结论

3.1 黄芪发酵后多糖在凝胶中呈现单一斑点，表明其分子自身所带电荷在一定范围内呈均匀连续分布；发酵后多糖的电泳迁移率与未发酵的电泳迁移率相比有所提高，表明发酵后电荷量明显增加，可利用琼脂糖凝胶电泳对其进行定性鉴别。

3.2 黄芪经侧耳菌发酵后多糖的得率和含量都显著提高，充分体现了中药发酵可以使其活性成分较大限度释放的优点。本实验室将进一步通过HPLC建立黄芪指纹图谱分析黄芪发酵前后其他有效成分的变化，对其药理药效作进一步的研究。

[1]李国红,张克勤,沈月毛.枯草芽孢杆菌对50种中药的发酵及抗菌活性检测[J].中药材,2006,29（2）：154-157.

[2]Yang F,Ke Y,Kuo S,et al.Effect of fatty acids on the mycelial growth and polysaccharide formation by Ganoderms lucidum in shake flask culture[J].Enzym Microb Technol,2000, 27：295-301.

[3]王兴红,李旗德,曹秋娥.微生物发酵中药应成为中药研究的新内容[J].中草药,2001,32（3）：267-268.

[4]庄毅,洪净.药用真菌双向性固体发酵工程与中成药药渣再开发[J].中国中药杂志,2006,31（22）：1918-1919.

[5]王玲,陈健,姜建国,等.沙海参多糖的分离和特性研究[J].现代食品科技,2008,24（7）：655-657.

[6]Hata R,Nagai Y.A micro colorimetric determination of acidic glycosaminoglycans by two dimensional electrophoresis on a cellulose acetate strip[J].Anal Biochem,1973,52（2）：652-656.

[7]赵龙,阮美娟,秦学会,等.蒽酮-硫酸法测定慈姑中多糖的含量[J].食品研究与开发,2009,30（12）：118-121.

[8]朱奎礼,陈涛,陈浩.硫酸化香菇多糖的琼脂糖电泳鉴别[J].中国生化药物杂志,2004,25（6）：356-357.

[9]Shao BM,Xu W,Dai H.A study on the immune receptors for polysaccharides from the roots of Astragalus membranaceusm,a Chinese medicinal herb[J].Biochem Biophys Res Commun,2004, 20（4）：1103-1111.

[10]Yu SY,Ouyang HT,Yang JY,et al.Subchronic toxicity studies of Radix Astragali extract in rats and dogs and dogs[J].J Ethnopharmacol，2007,110（2）：352-355.

[11]Li J,Bao Y,Lam W,et al.Immunoregulatory and anti-tumor effects of polysaccharopeptide and Astragalus polysaccharides on tumor-bearing mice [J].Immunopharmacol Immunotoxicol, 2008,30（4）：771-782.

[12]李红民,黄仁泉,王亚洲.提高黄芪多糖提取收率的工艺研究[J].西北大学学报：自然科学版,2000,30（6）：509-510.

[13]刘瑞生,薛掌林,张述斌,等.黄芪多糖的提取和含量测定研究[J].广东饲料,2008,17（11）：37-38.

The analysis of components and content of polysaccharide in Radix Astragali fermented by Pleurotus ostreatus

CHEN Li-yan，LI Yue，ZHANG Ying，JIN Shuang，FANG Zi-ruo，WANG Wei-ming*（Heilongjiang Academy of Traditional Chinese Medicine,Harbin 150036,China）

With the bi-directional fermentation technique，Radix Astragali which was taken as drug-containing medium was fermented by Pleurotus ostreatus to obtain Radix Astragali fungal substance，and the change of components and content of polysaccharide in Radix Astragali fermented by Pleurotus ostreatus were investigated.Agarose gel electrophoresis (AGE)was used to study the feasibility of qualitative of determination of polysaccharide in Radix Astragali before and after fermentation，and anthrone-sulphuric acid method was used to determine the polysaccharide content.The electrophoretic results showed that polysaccharide had one spot and had different migration ratio which were 0.98 and 1.21 in raw and fermented materials.The extraction ratio of polysaccharide were 6.31%and 9.50%，while the contents of polysaccharide were 2.12%and 3.64%in raw and fermented Radix Astragali.The results indicated that agarose gel electrophoresis can be used as a qualitative identification method of polysaccharide in fermented Radix Astragali.In addition，after Radix Astragali was fermented by Pleurotus ostreatus，the extraction ratio and content of polysaccharide in Radix Astragali increased obviously.It showed advantage that Chinese medicine fermented by fungi can release active components considerably.

Radix Astragali；Pleurotus ostreatus；fermentation；polysaccharide

TS201.1

A

1002-0306（2011）10-0253-04

黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalusmembranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao或膜荚黄芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.的干燥根，含多糖、皂苷、黄酮、微量元素等多种化学成分，具有利尿、降压、强心、提高机体免疫力和抗衰老等药理作用。而侧耳菌系担子菌纲口蘑科侧耳属真菌，具有抗肿瘤、抗氧化、促进免疫及降低胆固醇等多种药理作用。二者在某些方面具有相似的功效，黄芪经侧耳菌发酵后得到的药性菌质的药效可能会产生协同作用，比两者单独应用或简单相加的疗效有所增强。微生物具有非常丰富的酶系统，有强大的分解、转化物质的能力。利用微生物发酵中药，不仅可对中药中的纤维、糖类、蛋白质等加以利用，同时中药中的一些成分可能诱导微生物的某些代谢途径发生变化，从而产生新的化合物。而且微生物还可对中药中的某些成分进行转化或修饰，产生新的化合物或引起中药中一些成分含量的变化[1-2]，将为活性化合物的筛选提供丰富的资源。通过微生物的生长代谢和生命活动来转化中草药,可以比一般的物理或化学的手段更大幅度地改变药性,提高疗效,降低毒副作用，扩大适应症[3]。实验采用新型（双向型）固体发酵技术[4]，选用药食两用真菌—侧耳菌为发酵菌种，以中药黄芪作为药性基质，进行固体发酵，采用琼脂糖凝胶电泳法对多糖成分进行定性鉴别，并应用蒽酮-硫酸法对其含量进行定量测定，比较黄芪发酵前后多糖的变化，为新药的研发提供了依据。

2010-10-25 *通讯联系人

陈丽艳（1971-），女，硕士，副主任药师，主要从事中药新药及保健食品的研究与开发工作。