葛花异黄酮提取工艺及其防醉功效的研究

卢 堃，杜先锋

（安徽农业大学茶与食品科技学院，安徽合肥230036）

葛花异黄酮提取工艺及其防醉功效的研究

卢 堃，杜先锋*

（安徽农业大学茶与食品科技学院，安徽合肥230036）

以单因素实验考察了浸提时间、浸提温度、固液比、乙醇浓度四因素对葛花异黄酮提取率的影响。通过正交实验确定了最佳工艺参数为：70%乙醇溶液，固液比1∶15，75℃水浴中浸提2h。以小鼠为实验对象，通过毒理学实验和防醉功效的研究，证明葛花异黄酮无毒性且可以显著提高酒后小鼠血清中乙醇脱氢酶（ADH）活力，从而加速酒精在体内的分解代谢。

葛花，异黄酮，提取工艺，防醉功效

葛花为豆科葛藤植物野葛或干葛藤的干燥花蕾，又名葛条花，是我国的传统药物[1]。性味甘凉，具有解酒醒脾的功效，主治伤酒发热烦渴、不思饮食、呕逆吐酸、吐血、肠风下血等症[2]。其主要功效成分为异黄酮类和皂苷类化合物[3]，经研究表明，这两类化合物可分别在免疫系统和内分泌系统发挥协调作用，它们共同作用可以改善酒精引起的新陈代谢异常状况[4-5]。本文对葛花中异黄酮的提取工艺进行了优化，确定了葛花异黄酮的最优提取工艺参数，并对其防醉作用进行了初步研究[6]。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

干葛花 购于霍山黄何葛业；56°北京红星二锅头 北京红星股份有限公司；实验动物 昆明种小白鼠，体重20～22g，购于安医大实验动物中心；血清（浆）乙醇脱氢酶（ADH）试剂盒 南京建成生物工程研究所第一分所；葛根素标准品 中国药品生物制品检定所；无水乙醇 分析纯，哈尔滨市化工试剂厂。

HX-200A型高速中药粉碎机 浙江省永康市溪岸五金药具厂；MA110型电子天平 上海良平仪器仪表有限公司；旋转蒸发器RE52AA 上海亚荣生化仪器厂；0PD-8喷雾干燥机 上海大川原干燥设备有限公司；DK-S28型电热恒温水浴锅 上海精宏实验设备有限公司；unicUV-2102C型紫外分光光度计 尤尼柯上海仪器有限公司；TD5A-WS台式低速离心机。

1.2 实验方法

1.2.1 葛根素标准工作曲线的绘制 称取葛根素标准品5.00mg于10mL小烧杯中，加入适量的95%乙醇溶液充分溶解。将溶液移入25mL容量瓶中，再以适量同样的乙醇洗涤烧杯几次，并全部移入容量瓶中，加95%乙醇定容至刻度并摇匀；依次吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL分别置于5个10mL容量瓶中，95%的乙醇补足1.0mL。加蒸馏水稀释定容至刻度，摇匀。同时取95%乙醇1.0mL，用蒸馏水稀释至10mL，作为空白对照，在250nm波长紫外线下分别测定吸光度[7]。分析数据，得到吸光度与葛根素浓度的线性关系式，绘制葛根素标准工作曲线（如图1）。最小二乘法的吸光值Y对葛根素浓度X（mg/mL）的回归方程为Y=75.425X-0.0339（R2=0.9997）。

图1 葛根素标准品对照曲线

1.2.2 葛花异黄酮含量的测定

1.2.2.1 实验步骤 葛花→粉碎→过筛→溶剂加热回流提取→离心20min→吸取上清液测定其250nm吸光度值

1.2.2.2 测定方法 吸取过滤后葛花提取液上清液5mL置于25mL容量瓶中，用95%乙醇定容至刻度，摇匀；吸取1mL溶液置于10mL容量瓶中，加蒸馏水稀释定容至刻度，摇匀；以95%乙醇1mL作为空白对照，于250nm波长紫外光下测定吸光度，然后由标准曲线计算出待测葛花提取液中异黄酮浓度，再计算异黄酮的提取率。

葛花异黄酮提取率（mg/g）=（C×V）/m

式中：C：葛花提取液异黄酮浓度（mg/mL）；V：待测提取液的体积（mL）；m：干葛花粉的质量（g）。

1.2.3 葛花异黄酮最佳提取条件的优化 以浸提温度、料液比、浸提时间、乙醇浓度为因素，做单因素实验，然后按表1做L9（34）正交实验，以异黄酮提取率为指标，优化葛花异黄酮的最佳提取条件。

表1 葛花异黄酮提取因素水平表

1.2.4 防醉药效的初步研究

总体来说，这一时期河南省宗教工作，注重引导宗教界自我革新，充分完成了宗教界的革新需求，全面坚持贯彻了国家的宗教政策，依法加强对宗教事务的管理，扩大了爱国统一战线。同时，客观地讲，这一时期的宗教工作也存在着一些问题，如有些地方在反帝爱国运动中，对争取天主教虔诚教徒和神职人员方面，缺乏全面正确的认识，要求过高过急，对他们实行讽刺打击，从而造成了先进与后进分子的对立情况。又如部分工作人员对于宗教工作的长期性、复杂性、艰苦性认识不足，在工作取得初步成效后产生了自满情绪与麻痹思想，但自1953年起，这些现象已经受到重视，并得到了纠正。

1.2.4.1 样品制备 葛花→粉碎→过筛→溶剂加热回流提取→离心20min→浓缩→喷雾干燥→将粉末配制成相应浓度，待用

1.2.4.2 急性毒性实验 选取体重为20g左右的小鼠20只，雌雄各半，分为4组，每组5只，每只小鼠每次灌胃0.3g/mL的样品0.5mL，每d三次，间隔时间6h。给药1d，连续观察7d，观察小鼠是否有异常反应[8]。

1.2.4.3 饮酒量的确定 体重为20g左右的小鼠20只，雌雄各半，随机分为4组，每组5只，每组分别按比例（酒量∶体重）灌胃饮用56°北京红星二锅头白酒0.1、0.15、0.2、0.25mL/10g，观察小鼠醉酒及死亡情况。小鼠醉酒与否以翻正反射消失作为指标，即将小鼠背面向下轻放在动物笼内，若仰卧姿势保持在30s以上，则认为翻正反射消失。

1.2.4.4 小白鼠血药饱和 小白鼠40只，雌雄各半，随机分为4组，分别灌胃超纯水，浓度为0.09、0.18、 0.45g/mL的样液0.5mL，每d定时一次，连续灌胃3d，使小白鼠达到血药饱和，第3d灌胃前给小鼠禁食不禁水12h。

1.2.4.5 防醉药效实验 防醉药效实验即先灌胃药物再灌胃饮用酒。在第3d给药后，隔1h后按比例灌胃56°北京红星二锅头，观察小鼠反应。2h后每组随机抽取雌雄各3只，眼球取血，按照乙醇脱氢酶（ADH）试剂盒的检测方法测定血清中乙醇脱氢酶的活力[9]。

2 结果与分析

2.1 异黄酮提取工艺的优化

2.1.1 单因素实验

图2 浸提温度对葛花异黄酮提取率的影响

由图2可以看出，随浸提温度升高，样品异黄酮的提取率增大。另外，温度高，扩散系数增大，使浸提的速度加快，但是温度过高会导致黄酮结构的破坏，使其部分被氧化变性，由图2可知，在大于70℃后葛花异黄酮的提取率开始降低。

2.1.1.2 固液比对提取率的影响 称取一定量的葛花粉碎样，其他的提取条件不变，浸提温度70℃，再根据不同的固液比（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25）加入70%乙醇溶液，研究不同的固液比对浸提效果的影响，结果如图3。

图3 固液比对葛花异黄酮提取率的影响

由图3可知，固液比过低，原料中的异黄酮在介质中达到溶解平衡后，原料中剩余的异黄酮将不能继续溶出，提取率较低。随着浸提固液比的增加，葛花黄酮的提取率也随之提高。溶剂量增大，会直接影响到葛花异黄酮有效成分从原料内部向外部的扩散过程。当固液比超过1∶10时，提取率提高并不显著。

2.1.1.3 浸提时间对提取率的影响 称取一定量的葛花粉碎样，其他的提取条件不变，70%浓度乙醇，浸提温度70℃，分别设置提取时间为0.5、l、1.5、2、3h，研究不同的浸提时间对提取效果的影响，结果如图4。

图4 浸提时间对葛花异黄酮提取率的影响

由图4可以看出，在相同提取条件下，随浸提时间的增加，葛花异黄酮的提取率也随之提高。但是时间超过1.5h后，提取率增大不明显。其原因可能在于葛花异黄酮比较容易浸出，而质地疏松，蛋白质含量少，所以溶剂也易于渗入。这就导致超过1.5h后，葛花细胞内外溶剂浓度己逐渐达到平衡。另外，由于黄酮类物质本身易被氧化破坏，加热回流时间过长，可能不利于其母核的稳定性，会造成葛花异黄酮的部分降解，所以提取率在浸提时间过长时，提取率增加得不是特别明显。

2.1.1.4 溶剂中乙醇体积浓度对提取率的影响 实验设置50%、60%、70%、80%、90%五个乙醇浓度水平，固液比1∶10，在70℃水浴加热回流浸提1.5h。其他提取条件不变，比较乙醇浓度对浸提效果的影响，结果如图5。

图5 溶剂中乙醇体积浓度对葛花异黄酮提取率的影响

由图5可以看出，用较低浓度乙醇溶液提取时，浸出物的葛花粉碎样品总异黄酮含量较低，杂质较多。当使用60%、70%的乙醇溶液浸提时，葛根总黄酮的提取率较高，当乙醇浓度在70%时，其提取率为9.615mg/g。其原因是非黄酮类物质如蛋白质、多糖类会在较高浓度的乙醇中部分沉淀而分离除去，因此提取率会随乙醇浓度的增大而提高。当使用80%浓度以上乙醇溶液时，提取率反而降低，其可能的原因是乙醇浓度高会导致脂质类物质溶解量加大，而水溶性的物质溶解量减少，葛花总黄酮的含量相对减小。

2.1.2 正交实验 按表1进行正交实验，结果见表2。

由表2可以得出，四个因素的主次顺序为A>B>D> C，通过对四个因素均值的分析，确定最佳提取工艺为A2B3C2D2，即用70%的乙醇溶液，固液比1∶15，在75℃水浴回流浸提2.5h为葛花提取的最优方案。另外依据单因素实验中得出的结果，以及在实际的生产过程中出于对能耗的考虑，可以适当的降低浸提时间，故选择浸提时间为2h。

表2 L9（34）正交实验结果表

2.1.3 葛花异黄酮含量测定 依据上述单因素和正交实验选出最佳浸提条件，即葛花粉末用70%的乙醇溶液，固液比1∶15，在75℃水浴回流浸提2h为葛花提取的最优方案。根据此条件进行三组平行验证实验，最终所得葛花异黄酮提取率为9.853mg/g。

2.2 动物实验结果

2.2.1 急性毒理学实验结果 受试小鼠都没有异常反应，小鼠毛色光洁，饮食、活动和两便正常，鼻、眼、口腔无异常分泌物，未出现不良情况，也没有死亡情况。得到小鼠对本药物的最大耐受量≥22.5g/kg。

2.2.2 小鼠饮酒量的确定 结果显示，0.2mL/10g以上剂量组即有小鼠发生急性酒精中毒死亡，而0.15mL/10g剂量组小鼠翻正反射消失，使小鼠呈现醉酒状态而又无小鼠死亡，所以本实验选用0.15mL/10g为饮用酒量。

2.2.3 灌胃相同浓度样品的雌雄小鼠血乙醇脱氢酶活力平均值比较 对小鼠取血后，依照血清乙醇脱氢酶（ADH）试剂盒的检测方法测定小鼠血清中ADH活力，分别计算灌胃不同浓度样品的雌雄小鼠血乙醇脱氢酶活力的平均值，如图6。

图6 雌雄小鼠血乙醇脱氢酶活力平均值比较

由图6可知，小鼠血清乙醇脱氢酶活力随着样液浓度的增大而递增，说明样液可以显著提高醉酒小鼠血清中ADH的活力，从而起到解酒的效果。雌鼠和雄鼠血清ADH变化线基本呈平行状态，说明样液对雌雄作用并没有太大差异。

3 结论

通过单因素实验和正交实验得到葛花异黄酮最佳提取工艺，即以70%乙醇，浸提温度75℃，固液比为1∶ 15，回流提取2h，葛花异黄酮的提取率最高。但因乙醇浸提对动物实验有干扰，所以动物实验采用的是超纯水浸提。通过毒性实验和防醉药效实验表明，葛花异黄酮没有毒性，且具有明显增大小鼠血清中乙醇脱氢酶活力的作用，从而可以加速酒精在人体的分解代谢。

[1]尹俊亭，仲英，孙敬勇，等.葛花化学成分的研究（I）[J].中草药，2006，37（3）：350-352.

[2]中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京：人民卫生出版社，1963：270-271.

[3]张淑萍，张尊听.野葛花异黄酮化学成分研究[J].天然产物研究与开发，2005，17（5）：595-597.

[4]Kim C，Shin S，Ha H，et al.Study of substance changes in flowers of Pueraria thunber giana Benth.during storage[J].Arch Pharm Res，2003，26：210-213.

[5]Lee H W，Choo M K，Bea E A，et al.β-Glucuro nidase inhibitor tectorigenin isolated from the flower of pueraria thunber giana protects carbon tetrachloride-induced liver injury[J].Liver 1nt，2003，23：221-226.

[6]张会香，杨世军，张静.枳椇子总黄酮提取工艺及其解酒作用[J].食品与生物技术学报，2006，25（3）：84-87.

[7]李海涛.葛根有效成分的提取工艺及其解酒功效的研究[D].东北农业大学，2006.

[8]王珮珮，张玉，王凯平.当归多糖铁小鼠口服的急性毒性研究[J].中国医院药学杂志，2009，29（4）：271-272.

Study on extracting process of isoflavone from the flowers of Pueraria Lobata and its preventing alcoholism function

LU Kun,DU Xian-feng*
（College of Tea&Food Science and Technology,Anhui Agricultural University，Hefei 230036，China）

The effect of time，temperature，rate of solid to liquid，consistency of solvent on extraction rate of isoflavone from the flowers of Pueraria Lobata was studied.The best optimized extracting p1rocess were chosen by the orthogonal test:70%alcohol，the rate of solid to liquid was 1∶15，refluxing extracted 2h in 75℃water bath. Based on the toxicology and preventing alcoholism function experiments，the isoflavone of flowers of Pueraria Lobata has been proved no toxicity and can improve ADH vitality of mice's blood serum.Thus，the catabolism of alcohol in vivo was quickened.

flowers of Pueraria Lobata；isoflavone；extracting process；preventing alcoholism

TS201.2

B

1002-0306（2011）10-0364-04

2010-10-28 *通讯联系人

卢堃（1986-），女，在读硕士研究生，研究方向：营养与食品卫生学。