纤维蛋白溶解酶SPFE-I的溶栓活性及纤溶机理研究

秦芸桦，张 涛，江 波，*

（1.江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡214122；2.江南大学食品学院，江苏无锡214122）

纤维蛋白溶解酶SPFE-I的溶栓活性及纤溶机理研究

秦芸桦1，2，张 涛1，江 波1，*

（1.江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡214122；2.江南大学食品学院，江苏无锡214122）

采用体外实验和SDS-PAGE电泳法对纤维蛋白溶解酶SPFE-I的溶栓活性、抗凝活性及纤溶机理进行了研究。体外实验证明，该酶终浓度为0.12U/mL时具有体外抗凝血作用，血块在1.5U/mL酶液中的溶解率为72%；采用SDSPAGE电泳法研究发现，该酶可以水解纤维蛋白原的β、γ链，激活纤维蛋白溶酶原形成纤维蛋白溶解酶，并降解纤维蛋白溶解酶原激活剂抑制剂-1。

纤维蛋白溶解酶-I，溶栓，纤溶机理

1 材料与方法

1.1 材料与设备

SPFE-I 本实验室制备；牛血纤维蛋白原、纤维蛋白溶解酶原、凝血酶 中国生物制品检定所；低分子量标准蛋白 中国科学院生物化学所；其它试剂均为国产或进口分析纯。

PowerPac Basic电泳设备 美国Bio-Rad公司。

1.2 实验方法

1.2.1 抗凝血实验 小鼠眼球采血，分别取不同浓度的SPFE-I酶液1mL加入1mL血液中；另取一组生理盐水做比对实验；轻轻混匀后，37℃温箱孵育；每隔3h取出，观察血液的凝固状态[7]。

1.2.2 血凝块溶解实验 小鼠眼球采血，4℃自然凝固，滤纸吸干血栓表面，切成约0.2g的小块；加入1mL酶液（1.5U/mL），37℃下90r/min离心6h，测定凝血块的溶解率[7]；对照组加入1mL生理盐水。

1.2.3 纤维蛋白酶原的激活作用 将SPFE-I（终浓度为10μg/mL）加入至10mg/mL的纤维蛋白溶解酶原溶液，在37℃的恒温器中温育，于0、15、30、60、120min时不同时间取样。用SDS-APGE（分离胶浓度为10%）检测。

1.2.4 纤维蛋白原的水解作用 将SPFE-I（终浓度为10μg/mL）加入到10mg/mL的纤维蛋白原溶液中，在37℃的恒温器中温育，于0、5、15、30、60、120、180min时取样，用SDS-APGE（分离胶浓度为10%）检测。

1.2.5 对降解纤维蛋白溶解酶原激活剂抑制剂-1的降解作用 将SPFE-I（终浓度为10μg/mL）加入至10mg/mL的凝血酶溶液，在37℃的恒温器中温育，于60min时取样。用SDS-APGE（分离胶浓度为10%）检测。

1.2.6 SDS-PAGE分析 浓缩胶4%，分离胶浓度10%，酶液与样品缓冲液混合后，沸水浴中加热3min后上样，电泳条件为恒电流20mA。电泳后分离考马斯亮蓝R250（0.1%）染色显现蛋白带，甲醇∶乙酸∶水（1∶8∶8）脱色。

2 结果与讨论

2.1 SPFE-I的抗凝血实验结果分析

血液中存在两个对立统一的系统：凝血系统和溶血系统，在正常情况下，二者处于平衡状态，既保证血液在血管中畅通无阻，又保证一旦血管壁破损能够及时堵漏；在病理情况下，凝血系统功能亢进或纤溶系统功能降低，就形成血栓或有形成血栓的倾向。从表1可知，加入SPFE-I（终浓度为0.725U/mL）的试管没有凝血；加入SPFE-I（终浓度为0.12U/mL）的试管有部分血块出现；加入生理盐水的试管血液全部凝固。此实验说明了SPFE-I具有抗凝血作用，临界浓度大约是0.12U/mL。

表1 纤溶酶抗凝血作用

2.2 SPFE-I的血凝块溶解实验结果分析

血栓是指在活体的心脏和血管内血液凝固而形成的凝块。正常情况下人体内的血液是不会凝固的，因为在人体内有抗凝血因子和凝血因子相互制约。一旦这种相互制约关系受到干扰或破坏，就会出现病理现象，产生血栓。本实验加入酶液组血凝块溶解率为72%，对照组为12.5%，说明该纤维蛋白溶解酶具有使血凝块溶解的作用。

2.3 SPFE-I对纤溶酶原的激活作用

在生理条件下纤维蛋白溶解酶原在激活剂的作用下形成血纤维蛋白溶解酶，血纤维蛋白溶解酶能水解血栓中的纤维蛋白，形成可溶性降解产物，从而使血栓溶解。本实验室曾利用加热平板法证明，该酶具有激活纤维蛋白溶解酶原形成纤维蛋白溶解酶，间接降解纤维蛋白的作用，本实验利用SDS-PAGE证明其作用机理。由图2可知，SPFE-I将纤溶酶原降解成若干个片段a、b、c、d、e、f，其中片段a、d、f呈逐渐减少趋势，片段c先增多后减少，片段e呈现增多趋势，可能是血纤维蛋白溶解酶，但具体的酶切位点仍需进一步论证。

图1 纤溶酶原激活效果图

2.4 SPFE-I对纤维蛋白原的水解作用

纤维蛋白原是体内血栓的主要组成成分之一，它的分子是由三对两两相同的肽链（α、β、γ链）组成的二聚体；66.2ku处为α链，43.0ku与66.2ku之间是β链，43.0ku处为γ链。由图2可知，SPFE-I具有水解纤维蛋白原的作用，水解主要集中在β、γ链，没有水解α链。

图2 纤维蛋白原水解效果图注：M：marker；1：纤维蛋白原；2～8：0、5、15、30、60、120、180min时的水解状况。

2.5 SPFE-I对降解纤维蛋白溶解酶原激活剂抑制剂-1的降解作用

图3 SPFE-I对降解纤维蛋白溶解酶原激活剂抑制剂-1的降解作用注：1：低分子量标准蛋白；2：纤维蛋白溶解酶原激活剂抑制剂-1；3：纤维蛋白溶解酶原激活剂抑制剂-1+SPFE-I。

纤维蛋白溶解酶原激活剂抑制剂-1是组织型纤溶酶原激活剂的主要抑制剂，在纤维蛋白溶解作用的初级阶段调节脉管系统中的纤溶活性。体内的纤维蛋白溶解活性是由组织型纤溶酶原激活剂和纤维蛋白溶解酶原激活剂抑制剂-1的平衡决定的，但也可以通过纤维蛋白溶解酶原激活剂抑制剂-1和血浆中丝氨酸蛋白酶的相互作用改变[8]。

从图3中可以看出，SPFE-I可以降解纤维蛋白溶解酶原激活剂抑制剂-1，也就是说可以解除纤维蛋白溶解酶原激活剂抑制剂-1对tPA的抑制作用，间接地促进了溶解酶原激活纤维蛋白溶解酶，从而促进了纤维蛋白的水解。纤维蛋白是体内血栓的主要成分之一，SPFE-I降解纤维蛋白溶解酶原激活剂抑制剂-1，从而可以间接促进体内血栓的溶解。

3 结论

经研究证明，纤溶酶SPFE-I具有溶解血栓的作用，在浓度1.5U/mL时血凝块溶解率为72%；同时具有抗凝血作用，临界浓度大约是0.12U/mL。采用SDSPAGE电泳法研究其机理，表明它有三种作用方式：直接降解纤维蛋白的作用；激活纤溶酶原，从而间接降解纤维蛋白；降解纤维蛋白溶解酶原激活剂抑制剂-1，也就是说可以解除纤维蛋白溶解酶原激活剂抑制剂-1对tPA的抑制作用，间接地促进了溶解酶原激活纤维蛋白溶解酶，从而促进了纤维蛋白的水解。因此，该酶是一种很有开发潜力的溶栓酶。

[1]汪钟，郑植苓.现代血栓病学[M].北京：北京医科大学出版社，1997：523-532.

[2]王兆钺.溶栓治疗的现状及研究进展[J].国外医学内科学分册，2000，27（8）：323-326.

[3]Sumi H，Hamada H，Tsushima H，et al.A novel fibrinolytic enzyme （nattokinase）in the vegetable cheese natto：a typical and popular soybean food in the Japanese diet[J].Experientia，1987，15：1110-1111.

[4]Noh K A，Kim D H，Choi N S，et al.Isolation of fibrinolytic enzyme producing strains from Kimchi[J].Korean J Food Sci Technol，1999，31：219-223.

[5]Peng Y，Huang Q，Zhang R H，et al.Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme produced by Bacillus amyloliquefaciensDC-4screenedfromdouchi，atraditionalChinese soybean food[J].Comparative Biochemistry and Physiology，2003，134：45-52.

[6]Ying H，BO J，Yoshiinori M，et al.Purification and characterization of a novel fibrinolytic enzyme from Bacillus sp. nov.SK006 isolated from an Asian traditional fermented shrimp paste[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2008，56：1451-1457.

[7]王萍，陈钧，陈红斌.纳豆激酶分离纯化及体外溶栓和溶血作用研究[J].中国药学杂志，2005，40（21）：1669-1672.

[8]Tetsumei U，Hayato I，Kazuo U，et al.The Profibrinolytic Enzyme Subtilisin NAT Purified from Bacillus subtilis Cleaves and Inactivates Plasminogen Activator Inhibitor Type 1[J].The Journal of Biological Chemistry，2001，276：24690-24696.

Study on thrombolysis activity and fibrinolytic mechanism of SPFE-I

QIN Yun-hua1,2,ZHANG Tao1,JIANG Bo1,*
（1.StateKeyLaboratoryofFoodScienceandTechnology,JiangnanUniversity,Wuxi214122,China；2.SchoolofFoodScienceandTechnology,JiangnanUniversity,Wuxi214122,China）

Thrombolysis activity，anticoagulation activity and fibrinolytic mechanism of SPFE-I were studied by vivo experiment and SDS-PAGE.As a result，the enzyme had the function of anticoagulation in 0.12U/mL，and dissolving rate of blood clots in 1.5U/mL was 72%；β and γ-chains of fibrinogen were cut off by SPFE-I，plasminogen could be activted to from plasmin and plasminogen activator inhibitor-I was also able to be degraded by it.

fibrinolytic enzyme；thrombolysis；fibrinolytic mechanism

TS201.4

A

1002-0306（2011）10-0412-03

人体内的溶栓系统包括了纤维蛋白溶解酶原、纤维蛋白溶解酶、纤维蛋白溶解酶原激活剂和纤维蛋白溶解酶原激活剂抑制剂。体内的不溶性纤维蛋白会在血纤维蛋白溶解酶的作用下被降解为可溶性的降解物，而血纤维蛋白溶解酶是由纤维蛋白溶解酶原在纤维蛋白溶解酶原激活剂的作用下形成的。目前，国内外主要的溶栓剂有尿激酶、链激酶、组织性纤维蛋白溶解酶原激活剂等，其价格高昂，还有一定的副作用[1-2]，因而，寻找安全廉价的溶栓剂一直是研究的热点。目前，从发酵食品中筛选得到的溶栓剂有纳豆中的纳豆激酶[3]，韩国豆饼酱中的枯草激酶[4]，豆豉中的纤维蛋白溶解酶等[5]。本实验室从亚洲传统的食品——发酵虾酱中筛选到菌种Bacillus sp.nov SK006[6]，该菌种产有多种具有纤溶作用的纤维蛋白溶解酶，本文就其中一种纤维蛋白溶解酶SPFE-I的体外溶栓活性及其机理进行了研究。

2011-04-25 *通讯联系人

秦芸桦（1982-），女，博士研究生，研究方向：食品生物技术。

国家自然科学基金项目（20976073）；江南大学校内自主科研项目（JUSRP21107）。