荧光假单胞菌PSEUDOMONAS FLUORESCENCE SK17.001转化生产乳糖酸的条件研究

白会钗，张 于，江 波，沐万孟，张 涛

(江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡214122)

荧光假单胞菌PSEUDOMONAS FLUORESCENCE SK17.001转化生产乳糖酸的条件研究

白会钗，张 于，江 波*，沐万孟，张 涛

(江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡214122)

利用荧光假单胞菌SK17.001为出发菌株，转化乳糖生产乳糖酸。通过研究发酵条件和培养基成分对乳糖转化率影响，表明荧光假单胞菌SK17.001的最适合转化条件为:培养温度30℃，pH 6.5，250mL摇瓶中液体培养基装液量为30mL，摇床转速为200r/min，最佳氮源为1%蛋白胨和1%酵母膏，培养时间55h，乳糖浓度为3%时，转化率可达96%。

乳糖酸，荧光假单胞菌，生物转化

1 材料与方法

1.1 材料与设备

Pseudomonas fluroscence SK17.001 本实验室从土壤中筛选获得，并鉴定;乳糖 购自Fluka公司;其他试剂 市售，均为分析纯;斜面培养基 PDA;种子培养基(g/L) 蔗糖30，氯化钾0.5，磷酸氢二钾1，硫酸镁0.2，硝酸钠3，pH 6.2;发酵培养基(g/L) 乳糖30，蛋白胨10，酵母膏10，磷酸氢二钾2，硫酸镁1;底物浓度(g/L)30。

光照恒温培养箱，高压灭菌锅，电子天平，722型分光光度计，HPLC。

1.2 培养方法

从斜面中取一定量荧光假单胞菌接种于种子培养基，28℃，200r/min，培养20h;从种子培养基接种至摇瓶发酵产酶培养基中，接种量为6%，250mL摇瓶装液量30mL，温度28℃，摇床转速200r/min，振荡培养，检测乳糖酸的含量。

1.3 菌体生长浓度测定

采用722型分光光度计，在600nm下，测定菌液的OD值。

1.4 乳糖酸含量的测定

检测乳糖酸的方法如下:取发酵液离心，上清液灭酶经微孔滤膜过滤(0.22μm)，滤液上HPLC分析。HPLC条件:Agilent1100色谱柱:Shodex SH1011 (8.0mm×300mm)，流动相为0.01mol/L H2SO4。检测器:紫外检测器，210nm，柱温:50℃，流速:0.8mL/min，进样量:10μL，乳糖酸标样浓度:1%(w/v)。

乳糖酸浓度的计算方法:峰面积/1938×1%，

乳糖转化率的计算方法:C(LA)/C总(Lac) ×100%。

2 结果与分析

2.1 发酵条件对乳糖酸产量的影响

2.1.1 荧 光 假 单 胞 菌 Pseudomonasfluroscence SK17.001的生长曲线 由图1可知，0～8h为菌体生长的延滞期，11～23h为菌体生长的指数期，23h后菌体生长进入稳定期。

图1 培养时间对菌体生长量的影响

2.1.2 发酵时间对荧光假单胞菌转化乳糖酸的影响 由图2可以看出，菌在对数生长期内，乳糖的转化率极低;进入稳定期后，乳糖的转化率增大，随着时间的延长，转化率增加的较少;40h乳糖的转化率较高，55h乳糖的转化率达到95%。

图2 发酵时间对乳糖酸转化率的影响

2.1.3 培养温度对荧光假单胞菌转化乳糖酸的影响

从图3中可以看出，30℃时发酵液中乳糖酸的转化率较高，说明30℃比较适合菌体生长和产酶，随着温度的升高，乳糖酸的转化率急剧下降，在40～50℃时，乳糖酸转化率极低。

图3 温度对乳糖酸转化率的影响

2.1.4 pH变化对荧光假单胞菌转化乳糖酸的影响

由图4可知，当发酵培养基的pH为6.5时，发酵液中乳糖酸的转化率较高，由此可以说明，发酵产乳糖酸的最适pH为6.5左右，而过酸和碱性条件均不适合产乳糖酸。

图4 pH对乳糖酸转化率的影响

2.1.5 摇瓶液体装液量对乳糖转化率的影响 固定发酵过程中摇床的转速，通过改变摇瓶的装载量，可以实现发酵过程中的不同通气量，由此探讨通气量对乳糖酸转化率的影响，结果见图5。

图5 装液量对乳糖酸转化率的影响

从图5可以看出，装液量越少，乳糖的转化率越高，说明这种菌是一种需氧菌，在装液量20～30mL之间，装液量对底物转化率的影响并不显著。

2.1.6 接种量对乳糖转化率的影响 接种量对发酵产乳糖酸的影响并不太明显，在接种量为6%，即接种量为2mL左右时，乳糖的转化率较高。

图6 接种量对乳糖酸转化率的影响

2.2 培养基成分对乳糖转化率的影响

2.2.1 不同氮源对乳糖转化率的影响 氮同碳一样是构成微生物细胞结构和代谢产物中含氮物质的重要营养物质。在产酶培养基中，比较了几种常见的无机氮和有机氮对乳糖酸转化率的影响，结果如表1所示。

由表1可以看出，有机氮源蛋白胨和酵母膏比无机氮源适合菌体生长和乳糖酸的转化。蛋白胨和酵母膏的成分复杂，在发酵过程中，很有可能既作为碳源，又作为氮源被微生物利用。

在用蛋白胨和酵母膏作为有机氮源的转化培养基中，乳糖的转化率最高。

2.2.2 添加不同碳源对乳糖酸产量的影响 碳是构成微生物细胞结构和代谢产物中碳骨架来源的重要营养物质。在转化的基本培养基中，选取了几种比较常见的单糖，考察其对乳糖转化率的影响。

表1 不同氮源对乳糖转化率的影响

在转化培养基中，分别添加果糖和葡萄糖作为碳源，对乳糖的转化率进行检测，结果见表2。

表2 添加不同碳源对乳糖酸产量的影响

由表2可以看出，加入单糖后，乳糖的转化率基本为零，说明单糖可作为优势碳源被菌体利用，对乳糖的转化产生阻遏。在培养基中加入葡萄糖或果糖后，菌体生长量增长很快，说明此菌也许不能利用乳糖作为碳源，而单糖是优势碳源。

3 结论

本实验用的荧光假单胞菌 Pseudomonas fluroscence SK17.001在发酵培养基中氧化乳糖生成乳糖酸。菌种生长到平台期时，开始大量生成乳糖酸，表明转化生成乳糖酸的过程不是菌种生长所必需的，乳糖酸是一种次级代谢产物。

荧光假单胞菌是一种高度需氧的原核细菌，可利用葡萄糖，果糖等单糖作为碳源，进入机体进行代谢。可将乳糖氧化为乳糖酸，却不被微生物体所利用。

荧光假单胞菌Pseudomonas fluroscence SK17.001产乳糖酸的最佳培养条件为:培养温度30℃，pH6.5，250mL摇瓶中液体培养基装液量为30mL，摇床转速为200r/min，最佳氮源为1%蛋白胨和1%酵母膏，乳糖浓度为3%时，培养时间55h，转化率可达96%。

［1］Southard JH，Belzer FO.Organ preservation［J］.Annu Rev Med，1995，46:235.

［2］Shepherd RE，Issacson Y，Chensny L，et al.Lactobionic and Gluconic Acid Complexes of Fe II and Fe III;Control of Oxidation Pathways by an Organ Transplantation Preservant［J］.Inorg Biochem，1993，49:23－48.

［3］Isaacson Y，Salem O，Shepherd R E，et al.Lactobionic Acid as an Iron Chelator:A Rationale for its Effectiveness as an Organ Preserving［J］.Life Sciences，1989，45:2373.

［4］Hoffhine CE.Aqueous soluble salts o f erythromycin［P］.US Patent:2761859，1956.

［5］Sen Gupta ML，Bhattacharya N，Basu UP.Preparation of calcium lactobionate by electrolytic oxidation of lactose:Part I oxidation in electrolytic cell using stationary electrodes［J］.Indian Journal of Technology，1967，5:152－154.

［6］Gerling K G.Large－Scale Production of Lactobionic Acid－Use and New Applications［J］.International Dairy Federation，1998，9804:251－261.

［7］Hegenauer J，Saltman P，Ludwig D，et al.Iron－supplemented cow milk.Identification and spectral properties of iron bound to casein micelles［J］.J Agric Food Chem，1979，27(6):1294－1300.

［8］Toshiaki S，Shuichi Y，Seiichiro A，et al.Mineral absorption promoters containing lactobionic acid［P］.Japanese Patent: 07277991，1995a.

［9］Toshiaki S，Shuichi Y，Tomoko K，et al.Bifidus factors containing lactobionic acid ［P］ .Japanese Patent: 07277990，1995b.

［10］Gerling KG，Wilke D.Washing or detergent composition containing lactobionic acid or lactobionic acid salts［P］.US Patent:5069808，1991.

［11］Berardesca E，Distante F，Vignoli GP，et al.Alpha hydroxy acids modulate stratum corneum barrier function［J］.Brit J Dermatol，1997，137:934－8.

［11］Green JW.The halogen oxidation of simple carbohydrates. Advanced in Carbohydrate Chemistry［M］.New York:Acad Press，1948.

［12］Mikkel Nordkvist，Per Munk Nielsen，John Villadsen. Oxidation of Lactose to Lactobionic Acid by a Microdochium nivale Carbohydrate Oxidase:Kinetics and Operational Stability［J］.Biotechnology and Bioengineering，2007，97:694－707.

［13］Murakami H，Kawano J，Yoshizumi H，et al.Screening of lactobionic acid producing microorganisms［J］.J Appl Glycosci，2002，49:469－477.

［14］Hiromi Murakami，et al.Production of Calcium Lactobionate by a Lactose－oxidizing Enzyme from Paraconiothyrium sp.KD－3［J］.J Appl Glycosci，2008，55:127－132.

Study on the conditions of lactobionic acid production from Pseudomonas fluorescence SK17.001

BAI Hui－chai，ZHANG Yu，JIANG Bo*，MU Wan－meng，ZHANG Tao
(State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

The strain of Pseudomonas fluorescence SK17.001 was used to convert lactose to lactobionic acid.The results were as follow:pH 6.5，30℃，with 30mL volume of liquid，1%peptone and 1%yeast extract，3%(w/v)lactose could be converted to lactobionic acid after 55h incubated，the ratio of conversion could reach to 96%.

lactobionic acid;Pseudomonas fluosecence;bioconversion

TS201.3

A

1002－0306(2011)12－0236－03

乳糖酸(lactobionic acid)是集抗老、保湿、抗氧化和促进机体更新等多种功效于一身的第三代果酸，本身存在于机体中，无刺激性问题。乳糖酸和金属螯合能够降低由于离子催化生产的氢氧基对组织的损伤［1］，因此可用在器官移植缓冲液中［2－3］，防止器官受到自由基的伤害;乳糖酸可促进大环内酯类抗生素的溶解性，如红霉素的乳糖酸水溶液的溶解性比红霉素高出50～100倍［4］;乳糖酸钙的溶解性较高，可用来补充钙的吸收，也可用来做葡萄糖酸钙的过饱和溶液［5］。乳糖酸可以降低酸味，减少成熟时间［6］，促进矿物质盐的吸收，不增加氧化的风味和气味［7－9］。乳糖酸还可用来降解生物物质，作为洗涤剂的成分［10］。乳糖酸具有最佳的保水性，可抗氧化，抗衰老，是化妆品中的主要组分。目前制备乳糖酸的方法有化学催化合成法［11］以及生物转化法［12］。化学合成法会产生多种副产物和化学污染物，使得分离、纯化步骤变得复杂。微生物转化法生产乳糖酸具有高效、低成本、转化率高、副产物少等优点［13－14］，因此近年来研究人员都在探索用生物转化的方法来制备乳糖酸。本实验采用的荧光假单胞菌(Pseudomonas fluroscence SK17.001)是从土壤中筛选到的，保藏于典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2010216。以乳糖为转化底物，添加碳源、氮源及无机盐组成发酵培养基。本实验对其转化条件和培养基组分对乳糖酸转化率的影响进行了研究。

2010－10－21 *通讯联系人

白会钗(1982－)，女，在读博士，研究方向:食品生物技术。