内源乳化法制备溶菌酶微胶囊的研究

刘若男，李俊华，杨严俊，*

(1.江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江南大学食品学院，江苏无锡 214122;

2.江南大学食品学院，江苏无锡 214122)

内源乳化法制备溶菌酶微胶囊的研究

刘若男1，李俊华2，杨严俊1，*

(1.江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江南大学食品学院，江苏无锡 214122;

2.江南大学食品学院，江苏无锡 214122)

研究了壳聚糖－海藻酸钠内源乳化法制备溶菌酶微胶囊的工艺条件。海藻酸钠浓度2.0%，溶菌酶浓度1.5%，壳聚糖浓度为0.3%，Span 80的添加量为油相体积的1.0%时，正交实验得出最佳制备条件为:碳酸钙与海藻酸钠质量比为7∶40，水相与油相体积比为30∶70，冰醋酸与碳酸钙质量比为1.4∶1。然后，研究了溶菌酶微胶囊的粒径分布以及在模拟胃肠液中的控制释放效果和包埋后的溶菌酶在模拟胃液中的稳定性。结果表明，微胶囊粒径大小为483.7μm，粒径分布指数为0.6;优化得到的微胶囊在模拟胃液中2h释放率为35.5%，在模拟肠液4h后总释放率达88.9%;模拟胃液处理后溶菌酶保留活性达90.0%。

海藻酸钠，壳聚糖，内源乳化，溶菌酶

溶菌酶(Lysozyme，EC3.2.1.17)又称细胞壁质酶(Muram idase)或 N－乙酰胞壁质聚糖水解酶(N－acetylmuramide glycano－hydralase)［1］。溶菌酶以溶解革兰氏阴性菌及革兰式阳性菌的细胞壁而具有溶菌作用。溶菌酶本身是一种无毒、无害、安全性很高的高盐基蛋白，具有抗菌、消炎、抗病毒、增强机体免疫力等作用。该酶与甘氨酸和聚合磷酸盐等配合使用，具有良好的防腐作用。其被添加到奶粉中不仅具有防腐作用，而且还有提高免疫力的作用。同时，溶菌酶对仔猪腹泻有防治作用，它与免疫球蛋白在功能上有着紧密的联系，并能与其他生命活性物质共同增强抗体的活性，从而杀灭细菌。溶菌酶作为添加剂添加至产品中时，光、氧、温度、pH等均会对溶菌酶的活力造成一定的影响，进而影响其加工贮存性。更重要的是，溶菌酶常被用于在肠道抗菌，但当其在消化道内处于胃液环境时，由于强酸性环境和胃蛋白酶的分解，溶菌酶的活性损失较大。所以，为了使溶菌酶在肠道内充分发挥其生理功能，本文采用常用的肠溶性壁材壳聚糖－海藻酸钠［2－3］，研究了内源乳化法制备溶菌酶微胶囊的工艺，优化得出最佳工艺条件，并进一步考察了微胶囊在模拟胃肠液中的释放效果。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

海藻酸钠 粘度10g/L，20℃/Pa·s≥0.02，国药集团化学试剂有限公司;壳聚糖 分子量570kDa，脱乙酰度80%，大连鑫蝶甲壳素有限公司;溶菌酶 康德生物科技有限公司;溶壁微胶囊菌 上海天呈科技有限公司;胃蛋白酶 活力1∶10000，Sigma公司。

RW 20 digital机械搅拌机 IKA公司;UV－2000可见光分光光度计 Unico公司;Mastersizer2000激光粒度仪 英国马尔文公司。

1.2 溶菌酶微胶囊的制备

采用二步内源乳化法制备海藻酸钠－壳聚糖溶菌酶微胶囊，基本工艺:2.0%(W/V)海藻酸钠溶液，依次加入碳酸钙，1.5%(W/V)的溶菌酶。400 r/m in机械搅拌，加入石蜡油(含一定量的Span80)，乳化15m in后加入20m L含有冰醋酸的石蜡油，搅拌1h。4℃静置2～4h后，将上层油相倒出，用pH4.5醋酸缓冲液洗涤胶囊，直到无残留油相。最后用0.3%的壳聚糖溶液包衣30m in，冷冻干燥得到溶菌酶微胶囊。

1.3 微胶囊的特性检测1.3.1 包封率及载药量的测定［4］准确称取10.0mg冻干微胶囊，加入10.0m L pH8.0的磷酸盐缓冲液，37℃下搅拌2h，微胶囊完全溶解后，4500 r/m in离心10m in，考马斯亮蓝法测定离心后上清液的蛋白质浓度。微胶囊包封率的计算公式如下:

1.3.2 体外模拟胃肠液中释放率的检测［5］准确称取10.0mg微胶囊冻干粉，置于50m L具塞锥形瓶中，加入不含胃蛋白酶的模拟胃液(simulated gastric fluid，SGF)10m L，在恒温摇床中于 37℃、100 r/m in 振摇2h。然后将微胶囊过滤，转移至10m L不含胰蛋白酶的模拟肠液中，定点取样(同时补充等量同温介质)。样液于4500 r/m in离心10min，测定上清液中蛋白质的浓度，方法同上。根据以下公式计算:

式中，Cn:第n个时间点所取样品浓度;V:释放介质总体积;Vi:第i个时间点的取样体积;Ci:第i个时间点所取样品浓度(V0及C0均为零);W:溶菌酶微胶囊的重量。

1.3.3 微胶囊稳定性的测定［5］将微胶囊冻干粉10.0mg置于50m L具塞锥形瓶中，加入模拟胃液SGF(微胶囊∶模拟胃液 =1∶20)，在恒温摇床上37℃、100 r/m in下振摇2h。然后将微胶囊过滤，加入破囊溶液5m L，在恒温摇床上在37℃，100 r/m in下振摇2h。完全溶解后，样液于4500 r/m in离心10min，测定上清液中蛋白的浓度及溶菌酶的保留活性。表示为:1.3.4 溶菌酶活性的测定［6］溶菌酶的比酶活以水解溶壁微胶囊菌(Micrococcuslysodeikticus)的速度恒量。步骤如下:

首先，配制pH6.24，0.1mol/L的磷酸盐缓冲液。将一定量的溶壁微胶囊菌菌悬液用pH6.24的磷酸盐缓冲液稀释，在450nm下，使其吸光度值达到0.8左右。溶菌酶底物溶液于25℃水浴中保温，用1cm比色皿装2.5m L底物于水浴中，加入0.5m L酶液开始计时，记下反应1m in时的读数E1以及反应2m in时的读数E2，用以下公式计算酶活:

式中:ΔE450:450nm处每 min吸光度的变化;Ew:每0.5m L所用酶溶液中含有酶的重量，mg;0.001:一个单位在每分钟内使吸光度下降0.001。

2 结果与讨论

2.1 碳酸钙添加量对微胶囊包封率及载药量的影响

选取水相与油相体积比为30∶70，冰醋酸与碳酸钙质量比为1.4∶1，表面活性剂添加量为油相体积的1.0%，考察碳酸钙与海藻酸钠质量比为 4∶40、7∶40、10∶40、15∶40、25∶40 对微胶囊质量的影响。

由图1可看出，碳酸钙与海藻酸钠的质量比在7∶40时，包封率较高，载药量较大。这主要是因为，Ca2+浓度过低，不足以形成海藻酸钙微胶囊;Ca2+浓度过高，凝胶收缩程度加强，因而包封率降低。

植物材料：橡胶草植株于2011年6月采自新疆石河子蘑菇湖边，后移栽至石河子大学农业科学重点实验室进行室内培养，培养温度为（20±3）℃，光照强度为2 000 Lx。

图1 碳酸钙添加量对微胶囊包封率及载药量的影响

2.2 水相与油相体积比对微胶囊包封率及载药量的影响

选取碳酸钙与海藻酸钠质量比为7∶40，冰醋酸与碳酸钙质量比1.4∶1，表面活性剂添加量为油相体积的是1%，考察了油相比例为30%、40%、50%、60%、70%对微胶囊质量的影响。

由图2可以看出，油相比例的变化对微胶囊包封率及载药量的影响相对比较明显。随着油相比例的增加，溶菌酶微胶囊的包封率及载药量都是增加的，故油相比例为70%最佳。如果油相比例过低，如30%时，包封率比较低，可能是由于油相较少，乳化不够充分，导致包封率较小。

2.3 冰醋酸添加量对微胶囊包封率及载药量的影响

选取碳酸钙与海藻酸钠质量比为7∶40，水相与油相体积比为30∶70，表面活性剂添加量为油相体积的1%，考察了冰醋酸与碳酸钙质量比为0.2∶1、

图2 水相与油相体积比对微胶囊包封率及载药量的影响0.6∶1、1.0∶1、1.4∶1 对微胶囊质量的影响。

由图3可看出，微胶囊包封率及载药量随着冰醋酸添加量的增加而升高。冰醋酸与碳酸钙之间为每分子碳酸钙与2分子冰醋酸反应［7］。当冰醋酸添加量较少时，溶解加入到海藻酸钠溶液中的碳酸钙低于化学计量比例。但当冰醋酸添加量继续增加时，包封率及载药量增加不是很明显，这主要是因为在后续工艺中，用pH4.5醋酸缓冲液洗涤微胶囊时，可以进一步溶解微胶囊内部没有溶解的碳酸钙，使冰醋酸与碳酸钙的比例对包封率和载药量的影响不是很大。

图3 冰醋酸添加量对微胶囊包封率及载药量的影响

2.4 Span80添加量对微胶囊包封率及载药量的影响

选取碳酸钙与海藻酸钠质量比为7∶40，水相与油相体积比为30∶70，冰醋酸与碳酸钙质量比1.4∶1，考察了表面活性剂添加量为油相体积的0、1%、2%时对微胶囊质量的影响。

由图4可以看出，表面活性剂的添加量对微胶囊的包封率及载药量影响甚微。但在实验中观察到，未添加Span80的微胶囊在体系中结团较为严重，粒径较大。而添加量为1%与2%时，观察到乳化体系稳定，粒径较小，最终选择Span80添加量为油相体积的1%。

图4 Span80添加量对微胶囊包封率及载药量的影响

2.5 正交实验确定最佳工艺条件

为确定溶菌酶胶囊制备的最佳条件，以碳酸钙加入量、油相比例及冰醋酸加入量为主要考察因素，以微胶囊包封率和载药量为考察指标进行正交实验，结果如表2所示。

表1 正交实验因素水平表

表2 正交实验设计与结果

由表2可知，三个因素的主次顺序为油相比例(B)＞碳酸钙添加量(A)＞冰醋酸添加量(C)。最佳工艺组合为A2B1C3，即碳酸钙添加量碳酸钙与海藻酸钠质量比为7∶40，水相与油相体积比为30∶70，冰醋酸与碳酸钙质量比为1.4∶1，此条件下实验制得的微胶囊包封率为89.9%，载药量为34.9%。

2.6 溶菌酶微胶囊特性研究

2.6.1 溶菌酶微胶囊的粒径分布 用Mastersizer 2000测定微胶囊粒径，结果如表3所示，其中粒径分布指数较小，说明制备的溶菌酶微胶囊大小较为均一。

图5 溶菌酶微胶囊的粒径分布

表3 溶菌酶微胶囊粒径测定结果

2.6.2 溶菌酶微胶囊胃肠内释放效果 由图6可以看出，用壳聚糖－海藻酸钠为壁材制备的溶菌酶，前2h在模拟胃液中释放率较低，后续在模拟肠液中，2h至3h之间有一突释过程，3h至6h缓慢释放，最终总释放率高达近90%。该微胶囊胃液中的低释放率和经过胃肠道后的高总释放率使溶菌酶在肠道内可以充分发挥其生理功能。

图6 溶菌酶微胶囊在模拟胃肠液内的释放

2.6.3 包埋后的溶菌酶经过人工模拟胃液后的活性研究 由表4可知，在模拟胃液中2h后，未包埋的溶菌酶活性只保留31.7%，而包埋后的溶菌酶活性能够保留90.0%。这说明，制备的溶菌酶微胶囊不仅可以使溶菌酶较少地在胃液中释放，同时还能大大降低胃液对未释放的溶菌酶活性的影响。

表4 包埋对溶菌酶活性的影响

3 结论

3.1 海藻酸钠浓度2%，溶菌酶浓度1.5%，壳聚糖浓度0.3%，Span 80的添加量为油相的1%时，内源乳化法制备溶菌酶微胶囊的最佳工艺条件为碳酸钙与海藻酸钠质量比为7∶40，水相与油相体积比为30∶70，冰醋酸与碳酸钙质量比为 1.4∶1。

3.2 通过对溶菌酶微胶囊的性质检测，结果显示:溶菌酶微胶囊平均粒径为483.7μm，粒径分布指数为0.6;溶菌酶微胶囊经过模拟胃液2h后，胶囊释放率35.5%，在胃液中未释放的溶菌酶经过胃液后，能够保留90.0%的活性;经过模拟肠液4h后，胶囊总释放率达88.9%。

［1］林向阳.溶菌酶及其应用研究［J］.中国食品添加剂，2005(6):104－106.

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［5］Kovvacs－Nolan J，Mine Y.Microencapsulation for the gastric passage and controlled intestinal release of immunoglobulin Y［J］.Journal of Immunological Methods，2005，296(1 －2):199－209.

［6］赵玉萍.溶菌酶测定方法的改进［J］.食品科技，2002(1):58－59.

［7］Catarina mSilva.Alginatemicrospheres prepared by internal gelation:Development and effect on insulin stability［J］.International Journal of Pharmaceutics，2006，311:1－10.

Study on the microcapsule of lysozyme prepared by internal emulsification method

LIU Ruo－nan1，LI Jun－hua2，YANG Yan－jun1，*
(1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi214122，China;
2.School of Food Science，Jiangnan University，Wuxi214122，China)

The preparation technique of microcapsule from chitosan－alginate sodium was investigated.When the concentration of alginate sodium，chitosan and lysozyme were 2.0%，0.3%，1.5%respectively，and the volume ratio of Span80 to oil was 1.0%，the results from orthogonalexperiments were that the mass ration of CaCO3to alginate sodium was 7∶40，and the ratio of water to oil was 30∶70，and，and the mass ratio of glacial acetic acid to CaCO3was 1.4∶1.Then the size distribution of microencapsulation and the control－release property of the microcapsule of chitosan－alginate sodium in imitated stomach－liquid environment and the activity of embedded lysozyme in the imitated stomach－liquid were determined.The results showed that the size and SPAN factor of microencapsulation were 483.7μm and 0.6 respectively，the release ratio in imitated stomach－liquid after 2h was 35.5%，and the whole release ratio in imitated liquid after 4h was 88.9%，the activity of embedded lysozyme in the imitated stomachliquid was 90.0%。

alginate sodium;chitosan;internal gelation;lysozyme

TS201.2+5

B

1002－0306(2011)08－0318－04

2010－08－18 *通讯联系人

刘若男(1986－)，女，硕士研究生，研究方向:食品生物化学。