硅胶柱分离纯化发酵液中叶酸的工艺研究

刘 艳，薛正莲，胡刘秀，刘杉林，金 花

(1.安徽工程大学生物与化学工程学院，微生物发酵安徽省工程技术研究中心，安徽芜湖 241000;

2.芜湖张恒春药业有限公司，安徽芜湖 241009)

硅胶柱分离纯化发酵液中叶酸的工艺研究

刘 艳1，薛正莲1，胡刘秀2，刘杉林1，金 花2

(1.安徽工程大学生物与化学工程学院，微生物发酵安徽省工程技术研究中心，安徽芜湖 241000;

2.芜湖张恒春药业有限公司，安徽芜湖 241009)

采用硅胶柱层析法分离纯化产朊假丝酵母Y2.12发酵液，在考察洗脱剂种类、洗脱剂配比、上样液流速以及上样量这些单因素对叶酸分离效果的影响的基础上，通过响应面分析找出最优工艺参数。结果表明:产朊假丝酵母Y2.12发酵液分离纯化得到叶酸的最佳工艺条件为:上样液流速为1.26mL/min，发酵液上样量为5.29mL，洗脱剂乙醇与氨水之比1.84∶1，所提取的叶酸质量为(101.12±0.13)μg。

硅胶柱，叶酸，分离，产朊假丝酵母，响应面分析

叶酸(Folic acid)属于B族维生素，对细胞分裂和生长具有十分重要的作用［1－4］。人体缺乏叶酸会引发婴儿的核巨红细胞性贫血、孕妇的巨红细胞性贫血、新生儿的神经系统异常和老年痴呆症等疾病［5－8］，因此叶酸具有十分重要的药用价值和开发前景。由于目前工业化生产叶酸主要采用化学合成法，这种方法存在种种弊端，而发酵法生物合成叶酸存在着明显的优势，所以生物法合成叶酸具有十分重要的应用前景。本研究中心经紫外激光诱变，已筛选出一株产叶酸量高的菌种产朊假丝酵母Y2.12［9］，并对该菌种的发酵条件进行了优化，对高效地分离其有效成分具有十分重要的意义。硅胶其表面含有硅羟基，与极性化合物或不饱和化合物形成氢键从而具有吸附性能。从叶酸的分子结构来看，叶酸为不饱和分子，硅胶对它的吸附力不是特别强，因此，叶酸吸附在柱上易被洗脱。另外，硅胶是略带酸性的物质，适用于酸性和中性物质的分离，叶酸也带酸性，因此硅胶柱层析法可以很好地用于叶酸的分离纯化。SAS(statistical analysis system)统计软件，能用少量的实验次数和时间对实验进行全面的研究，取得明显有效的结论，避免了有交互作用的多因子实验可能造成的不可靠结论［10－13］。本实验借助响应面法对选育获得到的产朊假丝酵母Y2.12的发酵液进行分离纯化条件优化，旨在为生物法合成叶酸的工业化生产奠定坚实的基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

氯仿，浓盐酸，叶酸纯品 均为分析纯;截留分

子量14000的透析袋 北京经科宏达生物技术有限公司;100－200目柱层析硅胶 国药集团化学试剂有限公司;层析柱规格(内径×长度) 1.6cm×50cm。HD－21－88核酸蛋白检测仪、BSZ－100－LCD 自动部分收集器、BT1－100恒流泵 上海琪特分析仪器有限公司;UV－2550紫外可见分光光度计 日本岛津;SW－CJ－CO型双人净化工作台 苏州净化设备有限公司;BS－IE型振荡培养箱 上海新苗医疗器械制造有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 发酵液的制备 经激光和紫外复合诱变过的产朊假丝酵母Y2.12→菌种活化4d→摇瓶种子培养1d→发酵扩大培养2d即得

1.2.2 发酵液预处理 将发酵液倒入透析袋中，每隔6h换蒸馏水一次，透析48h。

1.2.3 发酵液的分离纯化

1.2.3.1 硅胶层析柱的填充 将硅胶于浓盐酸中浸泡24h后，不断加蒸馏水冲洗直至检验无氯离子为止，然后在110℃烘箱中活化2h。活化后的硅胶加氯仿浸泡并搅拌均匀，然后倾入层析柱中，并于上端铺一层脱脂棉。填充好的层析柱静置24h后，轻敲柱壁，以除气泡，再加2倍柱体积淋洗剂走柱子。

1.2.3.2 发酵液的分离 上样，移取预处理过的发酵液缓慢滴加到层析柱中进行分离纯化，使用自动部分收集器收集分离液，并用紫外可见分光光度计对分离液进行精确测定并绘制分离图确定峰高H、峰宽D、峰高峰宽之比R。

1.2.4 实验数据处理 利用单因素实验对洗脱剂种类、洗脱剂配比、上样液流速、发酵液上样量四个参数进行初步确定，再采用Box－Behnken响应面分析法对不同参数组合进行优化，因素及水平见表1。

表1 响应面分析因素水平表

2 结果与讨论

分离过程中，通过比较曲线的峰高峰宽之比R和出峰范围内的叶酸总质量M来综合评价分离条件的优劣。

2.1 洗脱剂种类的选择

固定上样液流速为0.7m L/m in，发酵液上样量为5m L，分别用甲醇、乙醇两种洗脱剂对发酵液进行分离，确定最佳洗脱剂的种类，所得结果见表2。

表2 不同种类洗脱剂对洗脱效果的影响

由表2可以看出，洗脱剂选用甲醇和乙醇的分离效果差距不大。但由于甲醇比乙醇更易挥发，并有较强的毒性，不利于分离食用叶酸，由此洗脱剂种类选用乙醇。

2.2 洗脱剂配比的确定

固定上样液流速为0.7m L/m in，发酵液上样量固定为5m L，分别用乙醇和氨水不同配比的洗脱剂进行硅胶柱层析分离实验，所得数据见表3。

表3 不同洗脱剂配比对洗脱效果的影响

由表3可知，洗脱剂中乙醇与氨水的比例为3∶1时，虽然峰宽D较大，但曲线峰高H、叶酸质量M均为最大，且与其余二组数据差距较大，分离纯化得到的叶酸多，所以洗脱剂配比初步确定为乙醇∶氨水=3∶1。

2.3 洗脱剂流速的确定

固定发酵液上样量为5m L，洗脱剂乙醇与氨水的比例为3∶1，调节不同上样液流速进行分离，所得结果见表4。

表4 不同上样液流速对洗脱效果的影响

由表4可以看出，流速为1.2m L/min时，曲线峰高H，峰高与峰宽比值R均为最大，叶酸质量M与流速为0.5m L/min或0.7m L/min时相差不大，起峰快且高，基本无拖尾现象，所以流速初步确定为1.2m L/min。

2.4 发酵液上样量的确定

固定洗脱剂乙醇与氨水的比例为3∶1，上样液流速为0.7m L/m in，调节不同发酵液上样量进行分离，所得结果见表5。

表5 不同发酵液上样量对洗脱效果的影响

由表5可知，发酵液上样量为4m L时，峰高H和叶酸质量M仅低于5m L时的曲线，且曲线R值最大，无拖尾现象。而上样量为5mL时R值太小，拖尾现象明显，分离效果不佳，所以发酵液上样量选用4m L。

2.5 Box－Behnken响应面分析

2.5.1 实验设计与结果 以叶酸浓度为响应值，采用三因素三水平的Box－Behnken响应面分析法，其中包括12个析因点实验，3个零点重复实验用于估计实验误差。实验结果如表6所示。

2.5.2 二次响应面回归模型的建立 以叶酸浓度为响应值，根据表6中的实验结果，采用SAS V8.0统计软件对表6中实验数据进行回归分析，建立以叶酸质量M为响应值的全变量二次回归方程，并进一步通过数据优化程序求得当响应面值最大时的各参数最优水平，所得方程如下:

表7 方差分析结果

表6 Box－Behnken实验设计结果

方程回归分析及方差分析见表7，响应面图见图1。由表7可知，回归模型极显著(Pmodel＜0.01)，失拟项在а=0.05水平上不显著(P=0.121579＞0.05)，其决定系数R2=0.9854，表明该模型拟合程度良好，可以用于叶酸发酵液分离工艺优化的理论预测。

从表 7 还可以看出 X1，X2，X3，X1X1，X2X2和X3X3为极显著因素。由响应面立体分析图可知，Y在一定三维变量区域内响应值Y存在最优值。通过回归方程可得知 X1、X2、X3优化后的确切值，X1=－0.26072，X2=0.32280，X3= －0.38581，此时可使得回归方程Y取得最大值:99.43905。由此可知，通过响应面法优化后硅胶柱层析分离中的各参数为:上样液流速 =1.26072m L/m in，发酵液上样量 =5.2912m L，洗脱剂配比 =1.84257∶1。结合仪器的可操作性，优化条件为上样液流速为1.26m L/min，发酵液上样量为 5.29m L，洗脱剂乙醇与氨水之比 =1.84∶1。

图 1 Y=f(X1，X2)，Y=f(X1，X3)，Y=f(X2，X3)响应面立体分析图

2.5.3 回归模型的验证实验 为证实预测结果，用以上得到的最优组合重复实验3次，叶酸产量为(101.12±0.13)μg，预测值与实验值之间良好的拟合性证实了该模型的有效性。并且峰高与峰宽比R较大，拖尾现象不明显，所以该工艺参数可以很好地用于发酵液中叶酸的分离。

3 结论

硅胶柱法分离纯化叶酸发酵液的最优条件为:上样液流速为1.26m L/m in，发酵液上样量为5.29m L，洗脱剂乙醇∶氨水 =1.84∶1，所提取的叶酸质量为(101.12 ±0.13)μg。

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Study on separation and purification of folic acid from fermented broth by silica gel column chromatography

LIU Yan1，XUE Zheng－lian1，HU Liu－xiu2，LIU Shan－lin1，JIN Hua2

(1.College of Biochemistry Engineering，Anhui Polytechnic University，Microorganism Fermentation Engineering and Technology Research Center of Anhui Province，Wuhu 241000，China;
2.Wuhu Zhang Heng Chun Medicine CO.，LTD.，Wuhu 241009，China)

Fermented broth of Candida utilis Y2.12 was separated and purified by silica gel column chromatography.The elution effects with different kinds of eluents，proportion of twoeluents，flow rate and loading amount were studied.Based on single factor experiments，the proportion of ethanol and ammonia，flow rate，loading amount were analyzed by response surface methodology.The results showed that the optimal separation technological parameters were as follows:1.26m L/m in flow rate，5.29m L loading amount，1.84∶1 the proportion of ethanol and ammonia.The weight of extracted folic acid was(101.12 ±0.13)μg.

silica gel column;folic acid;separation;Candida utilis;response surface methodology

TS201.1

B

1002－0306(2011)08－0304－04

2010－08－05

刘艳(1981－)，女，讲师，研究方向:食品加工。

国家教外司留(［2001］660);芜湖市科技计划项目(2008507);安徽工程大学重点青年基金项目(2007YQ006zd)。