高效液相色谱法测定表没食子儿茶素没食子酸酯含量

石萌萌，王 嘉，谢 瑶

(北京东方红航天生物技术股份有限公司，北京 100190)

高效液相色谱法测定表没食子儿茶素没食子酸酯含量

石萌萌，王 嘉，谢 瑶*

(北京东方红航天生物技术股份有限公司，北京 100190)

建立了一种利用高效液相色谱法(HPLC)测定绿茶提取物原料中表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)含量的方法。通过对流动相组成、色谱柱、流速及温度等色谱条件的选择及优化，得到了适合EGCG检测的色谱条件:色谱柱TSK－GEL®ODS－100V，流动相组成甲醇∶水∶乙酸=23∶75∶2的，流速1.0mL/min，检测波长276nm，柱温24℃。实验结果表明，EGCG在含有咖啡因及与EGCG类似物质的复杂体系中被快速、高效地检出。同时，该方法操作简单，检测效率高，重现性好，可以有效地节约实验成本，进一步证明了该方法可行性。在实际测定中，可以实现原料检测工作的快速、高效运行，适合企业对绿茶提取物原料中EGCG的质量控制。

绿茶提取物，EGCG，HPLC，测定，质量控制

饮茶在我国拥有悠久的历史，茶叶中的多酚对健康极为有利，它是茶叶中儿茶素类、丙酮类、酚酸类和花色素类化合物的总称。儿茶素类主要包括:表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、没食子酸儿茶素没食子酸酯(EGC)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)及表儿茶素(EC)。其中EGCG的含量最高，约占儿茶素总量的50%［1－2］。EGCG是一种抗氧化和清除自由基功能很强的活性物质，已作为一种抗癌新药成为现今科研和产品开发的热点［3］。它的抗氧化活性是VE的20倍、SOD的6倍［4］，具有明显的清除体内自由基、抗癌、抗炎、抗突变、抗衰老及改善肝功能等生物活性［4］。研究表明，EGCG能较全面地调节血脂，一方面，通过其自身的强抗氧化活性控制胆固醇的氧化，抑制脂质物在血管壁沉积;另一方面，抑制食物中不饱和脂肪酸的氧化，从而减少血清胆固醇含量及保持脂质在动脉壁的进入和移出的正常动态平衡［5］。目前，EGCG的检测方法主要包括容量法、比色法及原子吸收法［3］，但大多存在仪器要求复杂、灵敏度低等缺点。由于高效液相色谱技术具有分辨率高、分析速度快、重复性好、自动化程度高等优点，在食品原料检测方面已成为了重要的分析手段［8］。已报道的EGCG分离、纯化、制备的文献中涉及的一些检测方法［3，6－7］，大多未考虑EGCG与咖啡因的分离，但目前在保健食品中应用的绿茶提取物原料中，咖啡因含量对产品的质量控制非常重要，因此EGCG与咖啡因的分离尤为重要［1，16］。针对以上情况，本文对色谱条件进行了选择及优化，建立了简单、快速、准确检测绿茶提取物中EGCG的方法，适用于企业对绿茶提取物原料的质量控制。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

甲醇 fisher公司，色谱纯;超纯水 屈臣氏;乙酸 北京化学试剂公司，分析纯;EGCG标准品 杭州禾田生物技术有限公司，纯度＞99%;绿茶提取物 福州日冕科技开发有限公司。

高效液相色谱仪 配有996紫外检测器，515泵及M32色谱工作站，美国Waters公司;TSK－GEL® ODS－100V色谱柱 C18，3μm，4.6×150mm，东曹达(上海)贸易有限公司;BS210S型电子分析天平 德国Sartorius公司;LDZ4－0.8型医用离心机 北京医用离心机厂;KQ－250DB型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;振荡器 海门市其林贝尔仪器制造有限公司;FW80型高速万能粉碎机 苏州江东精密仪器有限公司;SHB－IIIA型真空泵 郑州长城科工贸有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 溶液的制备

1.2.1.1 样品制备 取绿茶提取物原料，准确称取约0.1g，加一定量纯水溶解，再定容至100mL容量瓶中，备用。

1.2.1.2 对照品制备 准确称取 EGCG对照品20.0mg，加一定量纯水溶解，再定容至50mL的容量瓶中，备用。

1.2.2 色谱条件的选择 分别精密吸取对照品与供试品溶液各20μL，注入高效液相色谱仪，记录峰面积，测定样品中EGCG的含量。

1.2.2.1 流动相组成的优化 在色谱柱为 Kromasil C18(5μm，4.6mm×150mm);进样量为20μL;检测波长为276nm;流速为1.0mL/min;柱温为室温的条件下，分别采用甲醇∶水∶乙酸(20∶79∶1)、甲醇∶水∶乙酸(28∶71∶1)、甲醇∶水∶乙酸(23∶75∶2)、甲醇∶水∶乙酸(18∶80∶2)、甲醇∶水∶乙酸(20∶78∶2)的不同流动相进行测定。

1.2.2.2 色谱柱的优化 在流动相采用甲醇∶水∶乙酸(23∶75∶2)，进样量为20μL，检测波长为276nm，流速为1.0mL/min，室温条件下，分别采用色谱柱Kromasil C18(5μm，4.6mm×150mm)、Kromasil C18(5μm，4.6mm ×250mm)、Inertail ODS－4 C18(5μm，4.6mm × 250mm)、TSK－GEL® ODS－100V(3μm，4.6 mm× 150mm)进行测定。

1.2.2.3 流速的优化 在色谱柱为TSK－GEL® ODS－100V(3μm，4.6 mm×150mm)，流动相为甲醇∶水∶乙酸(23∶75∶2)，进样量为20μL，检测波长为276nm，室温条件下，分别在1.0、0.9、0.8mL/min流速下进行测定。

1.2.2.4 温度的优化 在色谱柱为TSK－GEL®ODS－100V(3μm，4.6mm ×150mm)，流动相为甲醇∶水∶乙酸(23∶75∶2);进样量为20μL，检测波长为276nm，流速为1.0mL/min的条件下，分别将柱温度设定为28、26、25、24℃进行检测。

1.2.3 标准曲线测定 准确称取EGCG对照品9.0、19.5、29.7、39.6、51.3mg，分别加纯水溶解，再定容至50mL容量瓶中，备用。在流动相组成为:甲醇∶水∶乙酸=23∶75∶ 2;色谱柱为:TSK－GEL® ODS－100V (3μm，4.6×150mm);流速为 1.0mL/min;柱温为24℃条件下，精密吸取各浓度的对照品溶液20μL，注入高效液相色谱仪，记录峰面积。

1.2.4 精密度测定 在1.2.3中所述色谱条件下，准确吸取EGCG对照品溶液20μL，注入高效液相色谱仪，重复进样5次，记录峰面积及保留时间。

2 结果与讨论

2.1 流动相组成的优化

在其他色谱条件相同的情况下，分别对组成为甲醇∶水∶乙酸(20∶79∶1)、甲醇∶水∶乙酸(28∶71∶1)、甲醇∶水∶乙酸(23∶75∶2)、甲醇∶水∶乙酸(18∶80∶2)、甲醇∶水∶乙酸(20∶78∶2)的流动相进行考察，比较了不同流动相组成对EGCG保留时间和分离度的影响。

实验结果表明，随着甲醇含量的提高，EGCG的保留时间逐渐缩短，其与咖啡因的分离度出现先升高后下降的趋势。当甲醇含量为18%时，EGCG与咖啡因未能分开(见图1－A);当甲醇含量为20%时，EGCG与咖啡因分离度提高，但未能达到基线分离(见图1－B);当甲醇含量为23%时，EGCG与咖啡因分离度进一步提高，实现基线分离(见图1－C);当甲醇含量大于23%以后，分离度开始下降(见图1－D)。最终得到最优流动相组成为甲醇∶水∶乙酸=23∶75∶2。

2.2 色谱柱的优化

在其他参数相同的条件下，分别采用以下色谱柱进行实验:Kromasil C18(5μm，4.6mm×150mm)、Kromasil C18(5μm，4.6mm×250mm)、Inertail ODS－4 C18(5μm，4.6mm×250mm)、TSK－GEL®ODS－100V (3μm，4.6mm×150mm)。分别考察了色谱柱的填料类型、填料粒径、柱长几方面对绿茶提取物中EGCG与咖啡因分离度的影响，如表1所示。

表1 不同色谱柱条件下咖啡因与EGCG的分离度

绿茶提取物中的成分复杂，包括EGCG、咖啡因以及EGCG的多种类似物等，要实现EGCG的快速高效检测，就必须实现EGCG与其他物质的快速分离，由于EGCG与咖啡因出峰时间最为接近，因此以EGCG与咖啡因的分离情况为例，显示各色谱柱在EGCG检测中的性能，选择适合绿茶提取物中EGCG检测的色谱柱。

实验结果表明，色谱柱的长度对分离度的影响不大，但对保留时间影响较大。采用 Kromasil C185μm色谱柱进行分离，250mm与150mm的色谱柱检测所得分离度较为接近，效果没有太大差异性。采用250mm的色谱柱进行检测，EGCG的保留时间为20min左右，检测全程时间需要60min;而用150mm的色谱柱检测，EGCG的保留时间为6min左右，检测全程时间需要30min。在能够达到要求的情况下，选择150mm的色谱柱进行分离测定，以实现EGCG的快速、高效检测。

图1 不同流动相组成对绿茶提取物中ECGC与咖啡因的分离的影响

色谱柱填料的修饰情况及粒径对分离效果有一定的影响。色谱柱Kromasil C18，其填料为常规未经修饰的C18填料;Inertail ODS－4 C18与TSK－GEL® ODS－100V色谱柱，其填料均为C18经过一定修饰的填料。从表1中可以发现，填料修饰情况对EGCG与咖啡因的分离有一定影响;同时，从色谱柱填料粒径方面可以发现，随着粒径的减小，可以进一步提高EGCG在绿茶提取物复杂体系中的分离能力，如采用填料粒径为3μm的TSK－GEL®ODS－100V色谱柱进行分离，分离度可以达到2.40，表现出了较为显著的优势。综合考虑，选择色谱柱为TSK－GEL®ODS－100V(3μm，4.6×150mm)。

2.3 流速的优化

在色谱柱为TSK－GEL®ODS－100V;流动相为甲醇∶水∶乙酸(23∶75∶2);进样量为20μL;检测波长为276nm;柱温为室温的条件下，分别对流速为1.0、0.9、0.8mL/min进行实验。

实验结果显示，当流速为1.0mL/min时，EGCG与咖啡因能够得到较好的分离，分离度为2.19，并且EGCG与其后的EGCG类似物也能实现有效分开，分离度为5. 44;随着流速的降低，其对EGCG的分离情况影响不大。因此，在保证EGCG分离效果的前提下，最终选择流速为1.0mL/min。

2.4 温度的优化

在色谱柱为TSK－GEL®ODS－100V;流动相为甲醇∶水∶乙酸(23∶75∶2);进样量为20μL;检测波长为276nm;流速为1.0mL/min的条件下，分别选择柱温为28、26、25、24℃进行实验，考查不同温度对绿茶提取物中EGCG和咖啡因分离效果的影响。实验结果表明，EGCG与咖啡因的分离对温度较为敏感，且随着温度的升高，分离度呈下降趋势。在28、26℃时EGCG与咖啡因不能分开，为单峰;在25℃时EGCG与咖啡因分离不完全，分离度为0. 72;24℃时EGCG与咖啡因分离度为2.54，实现完全分离。故选择24℃为最佳的柱温。

2.5 线性关系

以峰面积(Y)对质量浓度(X)进行线性回归，其标准曲线如图2所示，回归方程为Y=29861582X－743171，r=0.9991，EGCG在0.2～1.0mg/mL浓度范围内线性良好。

图2ECGC的标准曲线

2.6 精密度分析

按照1.2.4方法对绿茶提取物中EGCG含量进行测定，连续5次进样所得峰面积及特征峰保留时间RSD分别为1.62%和0.69%(n=5)。结果表明，该方法精密度较好，进一步证明了方法的可行性。

3 结论

本方法在保证良好的精密度和线性关系的基础上检测绿茶提取物原料中EGCG的含量。经过反复实验，对色谱柱、流动相组成、流速、柱温等高效液相色谱条件进行了选择和优化。确定了色谱柱为TSK－GEL®ODS－100V，流动相组成为甲醇∶水∶乙酸= 23∶75∶2，流速为1.0mL/min，波长为276nm，柱温为24℃为绿茶提取物原料中检测EGCG的最佳参数。该方法分离效果好、精密度高、线性关系好，适用于保健品绿茶提取物原料中EGCG的测定，可作为产品原料质量控制的方法。

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Determination of epigallocatechin gallate in green tea extract by high performance liquid chromatography

SHI Meng－meng，WANG Jia，XIE Yao*
(Beijing Dawn Aerospace Bio－Tech CO.，LTD.，Beijing 100190，China)

A method for determination of EGCG by HPLC in green tea extract was developed.The chromatographic conditions including mobile phase composition，chromatographic column，flow rate and temperature were optimized.Exactly，TSK－GEL®ODS－100V column was used with the mobile phase of methanol:water:aceticacid (23∶75∶2)at column temperature of 24℃，and the flow rate was 1.0mL/min with UV detection at 276nm.The results showed that EGCG was rapidlly separated and detected in the complex system contained caffeine and EGCG similarities.With the advantages of simple，low cost，high efficency and good reproducibility，this method could be successfully used for quality control in the determination of EGCG in green tea extract.

green tea extract;EGCG;HPLC;determination;quality control

TS207.3

A

1002－0306(2011)12－0476－04

2011－08－31 *通讯联系人

石萌萌(1981－)，女，本科，工程师，从事保健品分析检测方向的研究。