响应面法优化微波辅助提取锁阳儿茶素的工艺研究

刘增根，党 军，江 磊，陈 晨，陶燕铎，梅丽娟，邵 赟，*

(1.中国科学院西北高原生物研究所，青海西宁 810001; 2.中国科学院研究生院，北京 100049)

响应面法优化微波辅助提取锁阳儿茶素的工艺研究

刘增根1，2，党 军1，2，江 磊1，2，陈 晨1，2，陶燕铎1，梅丽娟1，邵 赟1，*

(1.中国科学院西北高原生物研究所，青海西宁 810001; 2.中国科学院研究生院，北京 100049)

采用微波辅助技术进行锁阳儿茶素提取，利用响应面法对其工艺进行优化。通过单因素实验确定因素与水平，以儿茶素含量为考察指标，应用Box－Behnken设计3因素3水平实验，依据回归分析确定最优提取工艺条件。结果表明，微波辅助提取锁阳儿茶素的优化工艺条件为:提取时间13.3min，液料比13.6∶1(mL/g)，微波功率208.5W。采用该工艺条件，提取的儿茶素含量为3.82mg/g，与预测理论值的相对标准偏差为0.18%。

响应面分析，锁阳，儿茶素，微波辅助提取

锁阳(Cynomorium songaricum Rupr.)，又名不老药、地毛球、锈铁棒，为锁阳科锁阳属(Cynomorium L.)寄生植物锁阳的干燥肉质茎，常寄生于蒺藜科白刺属(Nitraria L.)植物根部，多生长于干旱与盐碱的沙地，主产于内蒙古、甘肃、青海、新疆等西北部地区，是中蒙药中的常用药。锁阳味甘性温，具有补肾益精、润肠养筋之功效，中医上用于治疗阳痿、遗精、不孕、腰膝酸软、肠燥便秘等［1］。现代药理学研究表明，锁阳具有提高机体免疫力、清除自由基、抑制人体免疫缺陷病毒［2－3］、抑制血小板聚集［4］等多种药理活性。根据其主要的药理作用，常艳旭等［5］认为锁阳中以儿茶素为代表的黄酮类，熊果酸为代表的三萜类，多糖及鞣质可以被看作是指标性成分。微波辅助提取技术具有设备简单、适用范围广、提取效率高、选择性强、重现性好、节省时间、节能、污染小等优点而被广泛应用于食品、化工、农业和中药材提取等领域［6］。本文采用微波辅助对锁阳儿茶素进行提取，并对影响锁阳儿茶素含量的几个重要因素进行了响应面分析(Response Surface Methodology，RSM)，并优化其工艺条件。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

锁阳药材 于2010年7月采自青海省柴达木地区，经中国科学院西北高原生物研究所梅丽娟高级工程师鉴定为锁阳(Cynomorium songaricum Rupr.);儿茶素对照品 批号为877－200001，中国药品生物制品检定所;甲醇 色谱纯，山东禹王试剂公司;磷酸 优级纯，天津兴华化学试剂厂;其余试剂 均为分析纯;超纯水。

WP800SL23－2微波实验仪(带回流、磁力搅拌)，SK5200HP科导超声波清洗器，UPT－I－5优普超纯水机，RE－52旋转蒸发仪，HH－6数显恒温水浴锅，Agilent1200LC高效液相色谱仪，AG204电子分析天平，101A－2E电热鼓风干燥箱。

1.2 实验方法

1.2.1 色谱条件及系统适应性实验 色谱柱: PLATISILTM－ODS(250×4.6mm，5μm);流动相:乙腈－0.3%磷酸溶液(10∶90);流速:1.0mL/min;柱温: 30℃;检测波长:210nm;理论塔板数按儿茶素峰计算应不低于3000。

1.2.2 样品溶液的制备 准确称取干燥锁阳粉末5.0g(过40目筛)，包入滤纸包，置于索氏提取器中，加60mL石油醚于圆底烧瓶中，回流提取90min进行脱脂，至溶剂无色，取出滤纸包挥干溶剂。再将适量乙醇放入圆底烧瓶，对样品进行微波辅助提取，趁热过滤，减压浓缩至干，即得锁阳提取物。称取适量提取物，用甲醇超声溶解后定容至25mL，摇匀，0.45μm微孔滤膜过滤，即得样品溶液。

1.2.3 儿茶素含量的测定

1.2.3.1 标准曲线的绘制 准确称取儿茶素对照品2.0mg，用甲醇溶解后定容至10mL，即得0.2mg/mL对照品溶液。分别精密吸取对照品溶液1.0、2.0、4.0、5.0、6.0、8.0、10.0、12.0μL，按上述色谱条件依次进样，以进样量X(μg)为横坐标，峰面积Y(mAU)为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程为:Y=8991.2X+ 156.27(r=0.9998)，儿茶素在0.2～2.4μg范围内与峰面积成良好的线性关系。

1.2.3.2 含量的测定 精密吸取样品溶液按绘制标准曲线的方法测定儿茶素峰面积，再根据儿茶素标准曲线即可计算样品溶液中儿茶素的含量。对照品溶液与样品溶液高效液相色谱图见图1。

图1 样品的高效液相色谱图

1.2.4 锁阳儿茶素最佳提取条件的确定 结合单因素实验结果分析，选择乙醇浓度、提取时间、液料比及微波功率四个因素，应用Box－Behnken设计3因素3水平的实验，并利用响应面法［7］对锁阳中儿茶素的微波提取条件进行优化。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验

2.1.1 乙醇浓度对锁阳儿茶素提取的影响 设定提取时间16min，液料比1∶12及微波功率200W，分别选择乙醇浓度为50%、60%、70%、80%、90%进行单因素实验，测定峰面积，计算儿茶素含量。如图2所示，随着乙醇浓度的提高，锁阳提取物中儿茶素含量变化不大，乙醇浓度为70%时，儿茶素含量相对最高。因此微波辅助提取时，选定70%的乙醇作为优化的乙醇浓度的单因素条件。

图2 乙醇浓度对儿茶素提取的影响

2.1.2 提取时间对锁阳儿茶素提取的影响 设定乙醇浓度70%，液料比1∶12及微波功率200W，分别选择提取时间为4、8、12、16、20、24min进行单因素实验，测定峰面积，计算儿茶素含量。由图3可看出，随着时间的增加，锁阳提取物中儿茶素含量先增加后减少，至12min时儿茶素含量最高，在时间超过16min后，儿茶素含量下降较快。由此可知，微波提取时间不宜过长。从缩短生产周期、节约能源等方面综合考虑，选定提取时间作为12min。

图3 提取时间对儿茶素提取的影响

2.1.3 液料比对锁阳儿茶素提取的影响 设定乙醇浓度70%，提取时间12min及微波功率200W，分别选择液料比为4∶1、8∶1、12∶1、16∶1、20∶1进行单因素实验，测定峰面积，计算儿茶素含量。由图4可知，随着液料比的增大，锁阳提取物中儿茶素含量逐渐增加，当液料比为12∶1～16∶1时，儿茶素含量增加量很少;当液料比继续增加时，儿茶素含量降低，可能是可溶性物质溶出太多，造成杂质含量增加。综合考虑提取液总量和提取效率两方面因素，选定12∶1作为优化的液料比的单因素条件。

图4 液料比对儿茶素提取的影响

2.1.4 微波功率对锁阳儿茶素提取的影响 设定乙醇浓度70%，提取时间12min及液料比12∶1，分别选择微波功率为100、150、200、250、300、350W进行单因素实验，测定峰面积，计算儿茶素含量。由图5可知，随着微波功率的增加，物质的加热程度也随之增加，使儿茶素能够较容易被提取出来，即含量增加;在微波功率达到200W之后，儿茶素含量逐渐降低，这可能是由于高微波功率的热效应导致儿茶素聚合或其他物质的溶出所致。因此选取200W作为优化的微波功率的单因素条件。

图5 微波功率对儿茶素提取的影响

2.2 响应面法对微波提取锁阳儿茶素提取条件的优化

2.2.1 响应面分析因素与水平的选取 根据Box－Benhnken的中心组合实验设计原理，综合2.1单因素影响实验结果，选取提取时间、液料比、微波功率对锁阳儿茶素提取影响较显著的3个因素，在单因素实验的基础上采用3因素3水平的响应面分析法(见表1)对锁阳中儿茶素的微波提取条件进行优化。

表1 响应面因素与水平

2.2.2 响应面分析实验设计方案 以提取时间A、液料比B、微波功率C为自变量，锁阳儿茶素含量为响应值(Y)，进行响应面分析实验。实验方案及结果见表2。

表2 响应面分析方案及实验结果

2.2.3 响应面回归模型的建立与分析 采用统计软件Design Expert 7.0对表2实验结果进行多元回归拟合，得到的二次回归方程模型为:Y=3.77+0.069A +0.23B+0.10C+0.092AB－0.22AC+0.047BC－0.13A2－0.33B2－0.30C2。实验方差分析及显著性检验结果见表3。

由表3可知，模型具有高度的显著性(P＜0.01)，进一步通过失拟项(P＞0.05)、校正确定系数(= 0.9316)及变异系数(C.V.=2.60%)说明该模型拟合度较好，实验方法可靠并能够很好地描述实验结果。从表3中还可看出，影响锁阳儿茶素提取的各因素按影响大小排序依次是B＞C＞A，其中液料比和微波功率的影响达到显著水平。

2.2.4 响应面图分析 微波辅助提取锁阳儿茶素的响应面图如图6～图8所示。图6为A(提取时间)和B(液料比)对儿茶素提取的响应面图。保持B为一定值时，儿茶素含量随着A的增加而升高，达到峰值后又快速降低;保持A为一定值时，随着B的增加，儿茶素含量也出现先升高后降低的趋势。等高线形状近乎呈圆形，表明提取时间和液料比两个因素间的交互作用较弱，这与表3的方差分析结果相吻合。

图6 Y=f(A，B)的响应面图

图7为A(提取时间)和C(微波功率)对儿茶素提取的响应面图。保持C为一定值时，儿茶素含量随着A的增加而升高，达到峰值后趋于降低;保持A为一定值时，随着B的增加，儿茶素含量也出现先升高后降低的趋势。等高线图呈扁圆形，表明提取时间和微波功率两个因素间具有较强的交互作用，这与表3的方差分析结果一致。

图7 Y=f(A，C)的响应面图

图8为B(液料比)和C(微波功率)对儿茶素提取的响应面图。随着B和C的增加，儿茶素含量先增加到最高，随后又下降，表明B和C对儿茶素提取的影响也是比较大的;而等高线图反映出两个因素间的交互作用极弱，与表3的方差分析结果一致。

图8 Y=f(B，C)的响应面图

为了得到最优提取工艺条件，对二次回归模型方程微分求解，得最优提取工艺参数为:液料比13.61∶1 (mL/g)，微波功率208.50W，提取时间13.33min。预测可获得的最高儿茶素含量为3.83mg/g。

2.2.5 验证性实验 为了检测实验结果是否与真实情况相一致，根据以上实验结果进行了验证性实验，考虑到实际操作的便利，将最佳工艺条件修正为:液料比13.6∶1(mL/g)，微波功率208.5W，提取时间

13.3min，在此条件下用70%乙醇进行5次平行实验，儿茶素平均含量3.82mg/g，RSD为1.07%，与预测的最大响应值的相对标准偏差为0.18%。因此，实验值与理论预测值相符，而且重复性也很好，说明优化结果可靠。

2.3 提取方法的比较

比较分析了3种提取法:乙醇加热回流提取法、乙醇微波辅助提取法(带磁力搅拌)和乙醇超声提取法，结果见表4。结果表明，微波法提取率均大于加热回流法和超声提取法，而且与其他提取方法相比，微波提取法热效率高、升温快速而均匀，能显著缩短提取时间、提高效率，而且所得有效成分(儿茶素)含量高，操作简便快捷，溶剂消耗及废物产生量低，故而可被广泛用于天然植物活性物质的提取中［8］。

表4 不同提取方法的比较

3 结论

采用微波辅助提取法从锁阳中提取分离出了儿茶素，并通过响应面分析得到了提取的优化条件:液料比13.6∶1(mL/g)，微波功率208.5W，提取时间13.3min，儿茶素含量3.82mg/g。本实验还讨论比较了微波提取与回流提取、超声提取的效果差异，结果表明，微波提取锁阳儿茶素耗时短、效率高、操作简便。该研究结果为锁阳在药物领域的深入研究与开发提供了一定的理论基础和参考。

［1］林佳.锁阳的研究进展［J］.国外医学中医·中药分册，2003，25(6):332.

［2］Yakuqaku Zasshi.Inhibitory effects of some traditional medicines on proliferation of HIV－1 and its protease［J］. Nakamura N，2004，124(8):519.

［3］Ma C，Nakamura N，Miyashiro H，et al.Inhibitory effects of constituents from cynomorium songaricum and related triterpene derivatives on HIV－1 protease［J］.Chem Pharm Bull，1999，47 (2):141.

［4］Zhang C Z，Wang S X，Zhang Y，et al.In vitro estrogenic activities of Chinese medicinal plants traditionally used for the management of menopausal symptoms［J］.J Ethnopharmacol，2005，98(3):295.

［5］Chang Y X，Su G E.Discuss on effective and targeted component of Cynomorium songarium Rupr［J］.Res Pract Chin Med，2005，19(3):55－60.

［6］潘学军，刘会洲，徐永源.微波辅助提取研究进展［J］.化学通报，1999(5):7－14.

［7］王燕，罗文谦，张志琪.响应表面优化法及其在天然产物成分提取中的应用［J］.安康学院学报，2009，21(1):77－81.

［8］聂金媛，张梦军，吴世容，等.微波辅助提取方法和技术在中药与天然产物研究与开发中的应用［J］.长沙大学学报，2003，17(4):40－43.

Optimization of microwave－assisted extraction of catechin from Cynomorium songaricum by response surface methodology

LIU Zeng－gen1，2，DANG Jun1，2，JIANG Lei1，2，CHEN Chen1，2，TAO Yan－duo1，MEI Li－juan1，SHAO Yun1，*
(1.Northwest Institute of Plateau Biology，Chinese Academy of Sciences，Xining 810001，China; 2.Graduate School of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100049，China)

Microwave－assisted extraction was applied for catechin extraction from Cynomorium songaricum.Based on the single factor experiment，the response surface method with three factors at three levels was adopted according to the Box－Behnken design.Content of catechin was used as response value，the factors of optimum conditions for the extraction were determined by regression analysis of response surface methodology.The results showed that the optimal catechin extraction process conditions were obtained by microwave－assisted extraction as follows:extraction time was 13.3min，liquid－solid ratio was 13.6∶1(mL/g)，and microwave power was 208.5W. Under the optimum conditions，the extraction content of catechin was 3.82mg/g，with relative standard deviation 0.18%compared with theoretical value.

response surface methodology;Cynomorium songaricum;catechin;microwave－assisted extraction

TS201.2

B

1002－0306(2011)12－0325－04

2010－12－08 *通讯联系人

刘增根(1987－)，男，在读硕士研究生，主要从事天然药物化学研究工作。

科技部国家科技支撑计划(2007BAI45B00)。