人骨髓间充质干细胞体外培养模型的建立和表型分析

刘长乐 ，李广平 ，郑心田 ，孟恒星 ，邱录贵 ，娄建石

（1.天津医科大学第二医院心脏科，天津300211；2.中国协和医科大学血液病学研究所，天津300020；3.天津医科大学药理学教研室，天津300070）

骨髓（bonemarrow，BM）中包含有两类干细胞，即造血干细胞和间充质干细胞 (mesenchymal stem cells，MSCs)。MSCs属混杂细胞群，其表面抗原标志尚未完全确定。MSCs作为多能干细胞具有可塑性，有报道显示在细胞因子作用下可以在体外诱导分化为骨骼肌细胞、脂肪细胞、心肌细胞、上皮细胞和血管内皮细胞，并且参与体内组织新生、损伤修复和重建[1]。本实验应用改进的密度梯度离心法、差异贴壁法和酶消化法建立MSCs的体外培养扩增模型，寻找高度特异性的表面抗原，以利于干细胞移植的广泛应用。

1 材料与方法

1.1 材料 （1）BM：39岁男性健康志愿者5mL。（2）仪器：FACScar流式细胞仪（Beckman-Coulter），倒置相差显微镜（OLYMPUS），荧光显微镜（OLYMPUS），恒温培养箱（Forma Scientific），高速低温离心机（Beckman-Coulter），细胞计数仪 KX21型（SYSMEX）。（3）试剂和材料：人淋巴细胞分离液（天津灏洋生物制品公司）、DMEM/F12+MCDB培养基（Invitrogen），FCS（hyclon），IGF（pepro tech），bFGF（pepro tech），EGF （pepro tech），CD34 IgG（Coulter），KDR IgG （R&D Systems），CD44 FITC（Genevale），CD45 FITC（Coulter），CD54 FITC（B&D），CD73 PE（B&D），CD90 FITC （B&D），CD105 PE（Laboratories），CD106 PE（Biole gend），IgG-FITC/PE（B&D）。

1.2 方法

1.2.1 MSCs的原代培养 抽取BM液5mL，肝素抗凝。DMEM+F12培养液稀释后，用人淋巴细胞分离液Ficoll（比重为1.077）密度梯度离心法，分离出单个核细胞。用DMEM+F12洗涤后，加入DMEM+F12与MCBD的混合培养液，并加入10%胎牛血清（FCS）、2 ng/mL bFGF、10 ng/mLEGF、10 ng/mL IGF。24 h后弃去未贴壁细胞，贴壁细胞继续培养，每4d半量换液，倒置相差显微镜每天观察生长情况，苏木-伊红（HE）染色观察摄片。

1.2.2 MSCs的传代培养 生长12 d后近融合时，用2mL 0.25%的胰蛋白酶+0.02%EDTA的消化液消化，以1:2～1:3传代。每天观察生长情况。

1.2.3 表面抗原检测 收集培养细胞，取1×104个细胞用PBS调整到100μL，经多聚甲醛固定后用流式细胞分析仪检测 CD34、CD45、CD54、CD44、CD73、CD90、CD105、CD106和KDR阳性表达百分比。

2 结果

2.1 倒置相差显微镜下直接观察细胞形态 从BM液中分离出的单个核细胞培养24 h后，可见散在贴壁细胞，并伸展为长梭形或多角形，即为原代MSCs（P0）。细胞呈克隆样成簇生长，初始细胞形态及大小不一。原代MSCs培养14 d，克隆生长细胞见有90%融合。第4代细胞形态渐趋均一化，生长速度快且倍增稳定。见图1、2。

2.2 HE染色 胞核呈蓝色、卵圆形，大而不规则，可见核仁，胞浆呈粉红色，胞质均匀，胞膜较清楚。见图3。

图3 MSCs（HE，×400）

2.3 MSCs表面抗原表达 流式细胞仪检测结果显示:CD44++、CD73++、CD90++、CD105++；CD54+、CD106+、CD34-、CD45-、KDR-。具体数值见图 4。

图4 MSCs表面抗原表达（%）

3 讨论

目前研究MSCs的生物学特性和增殖特点的关键是利用一种方法获得更为纯净、单一的MSCs。密度梯度离心是目前应用最多的方法，本实验结合自然贴壁法、酶消化法分离获得的细胞较多，而且增殖速度较快。BM单个核细胞接种24 h后有少量细胞贴壁，贴壁后分裂增殖逐渐伸展成梭形或多角形，贴壁第5天呈克隆样簇状生长，细胞数量扩增，生长速度加快。经传代培养扩增至第4代，细胞形态较为均一，生长倍增稳定。

目前鉴定MSCs的表面标记物具有非专一性和种属特异性，MSCs可以表达间质细胞、内皮细胞和表皮细胞的表面标志，以及多种细胞因子、粘附分子和生长因子的受体[1]。人MSCs与造血干细胞共同存在于BM中，但MSCs不表达典型造血细胞表面抗原，如造血干细胞标志抗原CD34、白细胞标志抗原CD45、单核/巨噬细胞表面抗原CD14等[2]。MSCs只表达 CD29、CD44、CD90、CD105、CD166 等基质细胞和间质细胞的特异性表面标志[3]。还有报道 CD105+、CD73+、CD90+和 CD45-、CD34-、CD14-这一细胞群代表MSCs[4]。

本实验中CD34在MSCs中表达量极小，说明不表达造血细胞的表面标志。CD45是泛白细胞标志物，又称白细胞共同抗原，有研究报道在用单克隆抗体磁珠分选MSCs组分时，发现CD45在MSCs有低水平的表达，但在人工培养下，很快即失去表达阳性[4]。本实验第4代MSCs显示CD45为阴性表达，与文献报道一致。血管内皮细胞生长因子受体2（kinase-insert domain contein ing receptor，KDR），主要表达在血管内皮细胞及胚胎内皮的前体细胞上。目前多数BM来源的内皮前体细胞具有某些血管内皮细胞表型，称之为内皮祖细胞。在本实验中，KDR在MSCs有微量表达，这些KDR+细胞亦可能是内皮祖细胞群，反映了MSCs与血管内皮细胞可能有一定的近缘关系[5]。CD106即血管细胞黏附分子（VCAM-1），可以表达于BM基质细胞，本实验MSCs中CD106弱阳性表达细胞占24.85%，显示出BM基质细胞的相关表型。CD54称为细胞间粘附分子-1(ICAM-1)，在人体内表达较局限，仅限于T、B淋巴细胞、单核细胞，某些上皮细胞、内皮细胞等。本实验MSCs呈中等量表达CD54，表明MSCs保留BM单核细胞的某些特性。CD44为一种粘附分子，是骨桥蛋白和透明质酸的受体，在BM的组成中起着重要作用，本实验CD44在MSCs表达呈强阳性也证实了其表型特异性[6]。CD105，又称转化生长因子-β，在BM前体细胞和单核细胞中表达，是构成细胞膜整体所必需的蛋白质。CD73存在于淋巴细胞B和T细胞亚群、滤泡树突细胞、上皮细胞等，可能是淋巴细胞的成熟标志。CD90同时表达于脑和淋巴组织。本实验此三种抗原均呈强阳性表达，与先前文献有一定差异，是一个值得注意的现象。我们认为 MSCs表型呈现：CD44++、CD73++、CD90++、CD105++；CD54+、CD106+、CD34-、CD45-的特征，表明各抗原表达差异明显，具有一定程度特异性，也证明所获取的MSCs纯度较高。

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