高效液相色谱法测定葡萄酒中生物胺的含量

沈念原，王秀芹(中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京100083)

高效液相色谱法测定葡萄酒中生物胺的含量

沈念原，王秀芹*(中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京100083)

葡萄酒是经过发酵而制成的，很容易存在生物胺，对人体可能存在危害，因此本文检测了几种葡萄酒中甲胺、乙胺、色胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺和亚精胺的含量。实验选用高效液相色谱仪，紫外检测器，0.1mol/L盐酸溶液提取，丹磺酰氯衍生化的方法进行检测。实验结果表明，此法相关系数大于99.8%，最低检测限在0.55～1.03μg/L，回收率大于95%，相对标准偏差在6.33%以下。实验结果检测出葡萄酒中甲胺含量为5.53±0.028～6.67±0.04mg/L，乙胺含量为5.41±0.07～6.99±0.19mg/L，色胺含量为10.35±0.068～14.18±0.42mg/L，腐胺含量为9.10±0.28～11.75±0.49mg/L，均在安全标准范围内，可安全食用。

高效液相色谱，生物胺，葡萄酒

生物胺是一类主要由氨基酸脱羧或醛和酮氨基化形成的弱碱性低分子量含氮化合物，常存在于动植物体内及微生物体内。生物胺不仅是生成荷尔蒙、核酸、蛋白质等的前体物质，也是生成致癌物质和亚硝基化合物的前体物质［1］。微量生物胺是生物体(包括人体)内的正常活性成分，但是，人体摄入过多的生物胺并进入血液中，易产生头痛、呼吸紊乱、心悸、血压变化等不良症状［2］。食品中常见的生物胺主要包括脂肪族(腐胺、尸胺、精胺、亚精胺等)、芳香族(酪胺、苯乙胺等)和杂环族(组胺、色胺等)生物胺［3］。生物胺存在于多种食品尤其是发酵食品中。生物胺中组胺对人类健康的影响最大，其次是酪胺［4］。200～800mg酪胺可引发轻微的血压升高，在酒精饮料中酪胺的上限为10g/mL［5］。发酵食品中允许的组胺含量范围是 50～100mg/kg，酪胺为 100～800mg/kg，苯乙胺为30mg/kg，食品中组胺的上限为100mg/kg，酒精饮料中的上限为20mg/kg，而每餐摄入40mg生物胺就被认为是潜在的危险［5］。酪胺 、苯乙胺和色胺等毒性较大，已有研究表明，苯乙胺和酪胺有升压作用，组胺有降压作用，色胺则具肝毒性，还能引起人血压升高，造成高血压，但现在很多国家尚未提出色胺的最大允许量［6］。目前已有多种方法应用于食品中生物胺的测定，如电化学生物传感器法、薄层色谱法、气相色谱法、离子色谱法和反相高效液相色谱法等［7］。HPLC具有分析速度快、柱效高、检测灵敏度高、定量分析准确的特点，是目前食品中生物胺含量分析测定的主要手段。

表1 HPLC法检测生物胺的线性范围、标准方程、相关系数、最低检出限(n=3)

表2 八种生物胺的回收率、相对标准偏差(n=3)

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

葡萄酒样 购于本地超市，三种葡萄酒，每种酒样购买三瓶，共9瓶;甲胺、乙胺、色胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺、丹磺酰氯 购于Sigma公司;乙腈 色谱纯;氨水、盐酸、氢氧化钠、碳酸氢钠 均为分析纯;娃哈哈纯净水。

WATERS高效液相色谱仪(HPLC)，Waters－Atlantisd C18色谱柱(4.6×250mm，ID，5μm)，UV/VIS探测器，泵，针筒式滤器(5mL)，微孔滤膜(0.45μm，25mm)，数显恒温水浴锅，分析天平。

1.2 色谱条件

选用WATERS高效液相色谱仪(HPLC)，Waters－Atlantisd C18色谱柱(4.6×250mm，ID，5μm)，UV/VIS探测器，检测波长为254nm，柱温为25℃，进样量为20μL，流动相为:乙腈∶水，比例为65∶35，v/v。

1.3 标准溶液的制备

取生物胺标准样10.0～18.0mg，用0.1mol/L HCl溶液溶解并转移到10mL容量瓶中，定容至刻度，封口，在黑暗中4℃保存。使用前，根据实验需要将此标准储备液用0.1mol/L HCl溶液稀释成1.78、2.37、3.55、7.11、35.55mg/L等五种不同梯度的溶液，进行RP－HPLC分析。

1.4 衍生过程

1mL样品与碳酸氢钠饱和溶液(200μL)，2mol/L NaOH(20μL)，2mL丹磺酰氯(10mg溶于1mL丙酮中)混合，混合液在70℃中水浴10min，反应后，加入1mL氨水(1mL水中溶解50mg氨水)使反应终止［8］。10min后，放入离心机中(3000r/min)离心10min，上清液用0.45μm滤膜过滤，滤液可直接进HPLC测定。

2 结果与讨论

2.1 标样测定

八种生物胺在本文的色谱条件下都能在35min内分离出来，并且峰形效果良好。分离时间分别为:甲胺4.6min，乙胺5.4min，色胺7.2min，腐胺9.9min，尸胺11.3min，组胺13.3min，酪胺24.5min，亚精胺29.9min。

2.2 标准曲线的测定及检出限

将标准溶液稀释成浓度为1.78、2.37、3.55、7.11、35.55mg/L的溶液，衍生化后进HPLC进行测定，每种浓度平行测定3次，并绘制出标准曲线图，得到相关的标准方程、相关系数以及最低检出限(LOD)。八种生物胺都呈线性关系，其中乙胺的相关系数为0.9998，组胺的相关系数为0.9982，且所有生物胺的相关系数都大于0.9982。以信噪比(S/N)为3进行最低检出限的检测，所得最低检出限为0.55～1.03μg/L，表明这八种生物胺的灵敏度都比较高，该方法能够检出含量较低的生物胺(表1)。

2.3 回收率的测定

向酒样中添加浓度分别为2.5、5.0、10.0mg/L的生物胺标样，每种添加样平行测定三次，选用外标法进行测定，所得结果见表2。平均回收率最低为乙胺:95.37%，最高为甲胺:103.37%，回收率在95%～104%之间，相对标准偏差在1.1%～6.33%之间，说明该方法重复性良好，测定结果较为准确(表2)。

2.4 葡萄酒中生物胺含量的测定

通过HPLC法对9瓶葡萄酒进行测定，发现所有样品中均没有尸胺、组胺、酪胺、亚精胺，甲胺、乙胺、腐胺、色胺为葡萄酒中主要生物胺。酒样3中甲胺和色胺含量比其他两种酒样含量分别低17.5%、23.9%(P≤0.05)，酒样2中乙胺含量最低，平均为5.83mg/L，腐胺含量在三种酒样中含量差别不大。每个品牌的三瓶葡萄酒中四种生物胺含量差别不大，除了腐胺在酒样3中含量比同样品牌的其他两瓶高出27.0%和28.6%(P≤0.05)。甲胺含量为5.53±0.028～6.67±0.04mg/L;乙胺含量为5.41±0.07～6.99±0.19mg/L;色胺含量为10.35±0.068～14.18±0.42mg/L;腐胺含量为9.10±0.28～11.75±0.49mg/L。色胺在三种酒中含量最高，其次为腐胺。三种酒的生物胺总含量变化不大，为31.81～36.72mg/L。酒样3中生物胺总含量最低，其次为酒样1，最高的是酒样2(表3)。

表3 葡萄酒中生物胺的含量(mg/L)

由于生物胺存在潜在的毒性，并且存在于大量的食物中，因而近年来一直被人们广泛研究。Kirschbaum等发现鱼酱里含有很高的酪胺、腐胺、色胺和组胺［9］。虾酱中普遍含有腐胺，相对来说，肉类、果汁和罐装蔬菜水果中的生物胺含量比较低［8］。本研究中的葡萄酒生物胺含量均未超标［10］。红葡萄酒酿造法是将葡萄果皮、果肉一起压榨而制成的，因此葡萄中的腐胺必然存在于葡萄酒中，在酿造过程中，腐胺可以源于鸟氨酸微生物脱羧，也可以是瓜氨酸或者是精氨酸等氨基酸的微生物新陈代谢;腐胺还可以通过精氨酸形成的胍丁胺生成。以上这些途径，是在几种红酒的苹果乳酸发酵过程中生成的乳酸细菌中发现的［11－12］，因此可以说明腐胺在葡萄酒中含量较高的原因。目前还没有葡萄酒中生物胺含量最大值的法律规定，但是酒精饮料中认为2～10mg/mL的组胺，10～80mg/L的酪胺，3mg/L的2－苯乙胺为有毒的界限［10，13］。不是所有生物胺都有同样的毒性，一般组胺、酪胺和苯乙胺是人们所关注的。

3 结论

本研究选用0.1mol/L盐酸溶液进行提取，经丹磺酰氯衍生化后进入HPLC进行测定。该方法建立的标准曲线相关系数都达到99%以上，回收率在95%以上，最低检测限为0.55～1.03μg/L，说明该方法方便快捷，稳定性和重复性都很好，能够快速准确地测定出葡萄酒中生物胺的含量。

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Determination of biogenic amines in wine by high performance liquid chromatography

SHEN Nian－yuan，WANG Xiu－qin*
(College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China)

Wine is easy to exist biogenic amines after fermentation and they may be harmful to humans.So this research studied methylamine，ethylamine，tryptamine，putrescine，cadaverine，histamine，tyramine，and spermidine in several kinds of wine.The method involved extraction with 0.1mol/L HCl solution，pre－column derivatization of the amines with dansyl chloride and subsequent analysis by high－performance liquid chromatography with UV detection.The results showed that the correlation coefficients were greater than 99.8%，the limit of detection was from 0.55μg/L to 1.03μg/L，recovery was more than 95%，relative standard deviations were below 6.33%.Levels of methylamine ethylamine tryptamine putrescine were 5.53±0.028～6.67±0.04mg/L，5.41±0.07～6.99±0.19mg/L，10.35±0.068～14.18±0.42mg/L，9.10±0.28～11.75±0.49mg/L，respectively.The results were in the safety standards and the wine could be safe to consume.

high performance liquid chromatography;biogenic amines;wine

TS207.3

A

1002－0306(2011)04－0394－03

2010－03－21 *通讯联系人

沈念原(1985－)，女，硕士研究生，研究方向:葡萄酒化学与酿造。